Singola molecola Imaging dei trasporti nucleari

L'involucro nucleare della cellula contiene circa 2000 complessi di pori nucleari che permettono il trasporto di molecole idrosolubili come RNA, ribosomi, alcune proteine, carboidrati e molecole di segnale. Aggiungendo molecole di carico marcate a cellule permeabilizzate, il movimento di singole molecole attraverso il poro nucleare può essere visualizzato mediante microscopia a fluorescenza. Sono necessarie immagini in time-lapse per determinare la localizzazione e le caratteristiche spaziotemporali, come il tempo di trasporto, l'efficienza di importazione ed esportazione e la frequenza di ingresso. Ciao, sono Alex ov, studente di dottorato del laboratorio di microscopia della singola molecola del Dipartimento di Biologia della Bowling Green State University.

Sono Asha P Shema, studentessa magistrale, anch'io del laboratorio di microscopia a singola molecola. Sono Juma, sono ricercatore post dottorato qui nel laboratorio di microscopia a singola molecola.

Oggi vi mostreremo un procedimento di imaging a livello di singola molecola del trasporto nucleare attraverso i complessi di pori nucleari nelle cellule helo. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la translocazione di diverse molecole attraverso il complesso di pori nucleari. Cominciamo dunque.

Per preparare le proteine per l'esperimento di trasporto nucleare, trasformare in modo convenzionale JM 1 0 9 E coli che esprimono i geni responsabili della produzione delle proteine cargo nucleari, coltivati in terreno LB e indotti con IPTG. Una volta che le cellule sono in fase logaritmica con una densità ottica compresa tra 0,7 e 0,8, centrifugare la coltura a 6.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius, scartare il sopranatante e pesare il pellet. Successivamente, risospendere le cellule in 10 millilitri di Celtic B per grammo per estrarre proteine adatte alla purificazione per affinità e all'analisi.

Successivamente, aggiungere la quantità appropriata di cocktail di proteasi nel DNA del plantare e nel beta-mercaptoetanolo. Mescolare la miscela al buio su ghiaccio per 30 minuti. Quindi centrifugare a 25.000 ×g per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, trasferire il soprannatante in un nuovo flacone in previsione della cromatografia. Aggiungere 400 microlitri di nickel NTA e acetone in quattro provette per microcentrifuga. Centrifugare a 16.000 ×g per tre minuti.

Scartare il sopranatante. Quindi aggiungere 400 microlitri di tampone di lisi e lavaggio. Ripetere i passaggi di lavaggio precedenti tre volte dopo l'ultimo lavaggio.

Risospendere la nichel NTA nel buffer di lisi e aggiungere le quattro provette al flacone contenente il sopranatante cellulare. Mescolare lentamente la miscela risultante in un contenitore al buio su ghiaccio per 60 minuti, mentre avviene l'agitazione. Preparare una colonna cromatografica Econo-Pac avvolgendola nella pellicola di alluminio per prevenire lo sbiancamento delle proteine fluorescenti.

Posizionare anche 12 provette di raccolta in un supporto sotto la colonna. Una volta che la miscela ha riposato per 60 minuti, caricare 10 millilitri della miscela SNA al nichel NTA e lasciarla passare completamente. Iniziare a raccogliere le frazioni.

Successivamente, aggiungere 10 millilitri di buffer di lavaggio per la lisi. Farlo passare completamente. Poi aggiungere 10 millilitri di buffer IZO e farlo passare.

Continuare a raccogliere le frazioni. Successivamente, far passare 0,5 millilitri di tampone di eluizione e lasciarlo attraversare, ripetendo l'eluizione con il tampone fino a quando non sono state raccolte tutte e 12 le frazioni. Per determinare quale frazione presenta la concentrazione più elevata della proteina, eseguire quattro microlitri di ogni frazione su un gel SDS-PAGE e colorare con Coomassie.

Secondo le procedure standard, unire le frazioni più concentrate e aggiungere 500 microlitri a un filtro nano step con una dimensione dei pori di 10 kilodalton, precedentemente risciacquato con tampone elucian. Concentrare la proteina centrifugando a 16.000 ×g per cinque minuti. Scartare il tampone, mescolare la frazione proteica rimanente e aggiungere altri 500 microlitri al filtro della centrifuga.

Ripetere nuovamente per tutte le frazioni selezionate. Successivamente, portare il volume finale della proteina concentrata a circa 50 microlitri con tampone eluente. Quindi, mentre si mescola delicatamente con una pipetta microlitrica prelevando dalla superficie del filtro, continuare a eseguire le colonne di scambio ionico e di esclusione molecolare per ottenere una proteina altamente pura e determinare la concentrazione proteica finale.

Successivamente, etichettare le molecole di carico con un colorante organico reattivo ausiliario in eccesso, come Alexa 555 o Alexa 647 maide. Questo passaggio è necessario perché la fluorescenza verde intrinseca della GFP non può essere utilizzata per l'immagine di singole molecole nel trasporto nucleare a causa della scarsa stabilità fotostatica e dello spettro sovrapposto alla autofluorescenza cellulare; la proteina etichettata deve essere suddivisa in diverse frazioni da 25 microlitri e conservata a meno 80 gradi Celsius un giorno prima degli esperimenti. Posizionare una lamella sterile in un piatto di Petri da 35 millimetri e aggiungere con una pipetta nove millilitri di DMEM.

Successivamente, pipettare un millilitro di coltura cellulare e distribuirlo uniformemente sul vetrino su cui le cellule sono state precedentemente ingegnerizzate geneticamente per esprimere una proteina di membrana etichettata con GFP, POM 1 21. Collocare le piastre nell'incubatore a anidride carbonica per 12 ore.

Nel giorno dell'esperimento, iniziare a preparare le camere di flusso. Successivamente, recuperare dal bagno termostatato il vetrino rivestito di cellule, asciugare delicatamente il vetrino, quindi montarlo utilizzando una colla a base di grasso da vuoto. All'interno di una cornice in alluminio realizzata in laboratorio, è essenziale assicurarsi che le cellule non si secchino durante la preparazione.

Utilizzando una siringa di plastica da 10 millilitri, aggiungere due linee di silicone su entrambi i lati di un coprioggetto con l'aiuto di pinzette. Prendere il piccolo coprioggetto preparato con le due linee di silicone e posizionarlo capovolto sopra il vetrino rivestito di cellule, premendo leggermente per formare la camera di flusso. Se vengono preparate due camere separate su un unico vetrino rivestito di cellule, è essenziale assicurare un buon sigillo per prevenire contaminazioni incrociate.

Applicare quindi diverse linee di grasso siliconico tra le camere, dalla parte superiore a quella inferiore del vetrino, per sigillarle separatamente. Posizionare inoltre diverse linee di grasso sui lati esterni delle camere. Aggiungere DMEM nella camera di flusso per evitare che le cellule si secchino.

Successivamente, utilizzando un bastoncino di cotone, lavare la parte inferiore del vetrino due volte con acqua e poi due volte con etanolo al 100%. Montare il vetrino sul microscopio. Lavare due volte con 25 microlitri di buffer di trasporto aggiungendolo alla camera di flusso ed aspirandolo.

Utilizzando un piccolo pezzo di carta da filtro applicato sul lato di uscita, permeabilizzare le cellule una volta per circa due minuti con 25 microlitri di digitonina, monitorando la permeabilizzazione in tempo reale mediante microscopia a campo chiaro. Infine, lavare le cellule con 25 microlitri di buffer di trasporto, integrato con il 1,5% di polivinilpirrolidone o PVP per prevenire il rigonfiamento osmotico dei nuclei. Posizionare le cellule permeabilizzate sul microscopio e identificare un anello fluorescente di colore verde brillante.

Quindi focalizzare l'equatore della cellula e acquisire un'immagine prima di aggiungere le molecole di carico fluorescenti. Eliminare qualsiasi autofluorescenza selezionando la regione dell'involucro nucleare e illuminando con il laser al neon elio a 633 nanometri fino a quando non sia completamente fotoblecata. Generalmente, sono necessari oltre due minuti.

Aggiungere il campione di destrano marcato diluito in buffer di trasporto con PVP al 1,5% alla camera di flusso in un volume di 25 microlitri e farlo scorrere attraverso la camera applicando una micca di carta filtro. È necessario fare attenzione durante l'aggiunta delle proteine di trasporto da importare e delle cellule permeabilizzate, poiché il fuoco può essere facilmente perturbato da qualsiasi movimento brusco. Attivare lo chopper ottico a circa cinque hertz per evitare il fotobiancamento e consentire a una nuova porzione di singole molecole non fotobiancate di avvicinarsi all'involucro nucleare.

Deve essere acquisita una serie di video di translocazione di singole molecole non appena le molecole del campione vengono aggiunte, in modo da poter catturare la translocazione attraverso i complessi dei pori nucleari. Utilizzare il laser all'elio-neon da 633 nanometri per illuminare le traiettorie di trasporto delle molecole in transito, eseguendo correttamente l'analisi. Questo protocollo consente la raccolta di una serie di immagini che illustrano la translocazione di singole molecole di carico in interazione con il complesso del poro nucleare.

In perme, lui r pom 1 21 cellule. Tracciando le traiettorie spaziali di singole molecole di dextrano in transito, è possibile distinguere i singoli passaggi del processo di diffusione attraverso l'involucro nucleare. Qui viene mostrato un evento dal citoplasma al nucleo, in cui una singola molecola di dextrano, rappresentata come un punto rosso, parte dal citoplasma, interagisce con l'involucro nucleare, mostrato come una linea verde di pixel, e termina all'interno del nucleo.

La molecola di destrano ha avuto origine nel citoplasma, ha interagito con l'involucro nucleare ed è ritornata nel citoplasma. In questo esempio, la molecola di destrano ha avuto origine nel nucleo, ha interagito con l'involucro nucleare ed è ritornata nel nucleo. E qui la molecola di destrano ha avuto origine nel nucleo, ha interagito con l'involucro nucleare ed è terminata nel citoplasma.

Tracciando le traiettorie spaziali di singole molecole di dextrano transing, è possibile distinguere i passaggi fini della diffusione attraverso l'involucro nucleare. Le traiettorie dell'evento mostrate come linee blu e punti vuoti sono state determinate e sovrapposte all'involucro nucleare, rappresentato come una linea nera. Le linee verde e rossa rappresentano una distanza di 100 nanometri dall'involucro nucleare rispettivamente dal lato citoplasmatico e da quello nucleare.

È stato appena mostrato come visualizzare la traslocazione di singole molecole attraverso il complesso del poro nucleare con una risoluzione di 10 nanometri a 400 microsecondi. Durante questa procedura, è importante ricordare la necessità di ottenere un rapporto segnale-rumore il più alto possibile e prestare molta attenzione durante l'esperimento su singole molecole, poiché la messa a fuoco può essere facilmente compromessa. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.