Name: Singola molecola Imaging dei trasporti nucleari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Scopri la microscopia a singola molecola per studiare il trasporto nucleare attraverso i pori nucleari nelle cellule HeLa. Questo metodo permette di analizzare la dinamica di importazione ed esportazione molecolare con alta risoluzione.

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Questo progetto è stato sostenuto dalla capacità Research Enhancement Grant (Bowling Green State University).

<ol><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li>
<li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Bisogna fare attenzione ad assicurare un adeguato colocalizzazione di molecole NE e singolo durante l&#39;esperimento. E &#39;inoltre importante fornire un alto rapporto segnale rumore, specialmente quando il segnale è basso a causa di etichettatura poveri o photobleaching. Precisione di localizzazione è limitata dal rumore di fondo (derivanti da out-of-focus fluorescenza, il rumore di lettura CCD, i fattori di corrente di buio e di altri).

singola molecola imaging dei trasporti nucleari

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

L&#39;utilità dei singoli approcci di microscopia a fluorescenza molecola ha dimostrato di essere di avvalersi grande nel capire le reazioni biologiche negli ultimi dieci anni. L&#39;indagine delle interazioni molecolari con alta risoluzione temporale e spaziale in profondità all&#39;interno delle cellule è rimasta difficile a causa dei segnali intrinsecamente debole derivanti da singole molecole. Opere recenti di Yang et al. dimostrato che il piccolo campo epifluorescenza permette la visualizzazione di trasporto nucleocytoplasmic a livello di singola molecola. Con l&#39;approccio singola molecola, la cinetica importanti, come il tempo di trasporto nucleare ed efficienza, per le molecole segnale carico-dipendenti e indipendenti sono stati ottenuti. Qui abbiamo descritto un protocollo per l&#39;approccio metodologico con una migliore risoluzione spazio-temporale di 0,4 ms e 12 nm. La risoluzione migliore ci ha permesso di catturare transitori trasporto attivo ed eventi diffusione passiva attraverso i complessi poro nucleare (NPC) in semi-intatte le cellule. Ci aspettiamo che questo metodo da utilizzare per chiarire altri eventi vincolante e il traffico all&#39;interno delle cellule.

Microscopia singola molecola approch fornito intuizioni romanzo in trasporto nucleare.

Singola molecola Imaging dei trasporti nucleari

L'utilità degli approcci di microscopia a fluorescenza a singola molecola si è dimostrata di grande valore nella comprensione delle reazioni biologiche nel corso del...

L'involucro nucleare della cellula contiene circa 2000 complessi di pori nucleari che permettono il trasporto di molecole idrosolubili come RNA, ribosomi, alcune proteine, carboidrati e molecole di segnale. Aggiungendo molecole di carico marcate a cellule permeabilizzate, il movimento di singole molecole attraverso il poro nucleare può essere visualizzato mediante microscopia a fluorescenza. Sono necessarie immagini in time-lapse per determinare la localizzazione e le caratteristiche spaziotemporali, come il tempo di trasporto, l'efficienza di importazione ed esportazione e la frequenza di ingresso. Ciao, sono Alex ov, studente di dottorato del laboratorio di microscopia della singola molecola del Dipartimento di Biologia della Bowling Green State University.Sono Asha P Shema, studentessa magistrale, anch'io del laboratorio di microscopia a singola molecola. Sono Juma, sono ricercatore post dottorato qui nel laboratorio di microscopia a singola molecola.Oggi vi mostreremo un procedimento di imaging a livello di singola molecola del trasporto nucleare attraverso i complessi di pori nucleari nelle cellule helo. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la tr

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Qui si descrive la strumentazione e metodi per la rilevazione di molecole proteiche singolo fluorescenza marcata che interagiscono con una singola molecola di DNA sospeso tra due microsfere otticamente intrappolati.

Combinando singola molecola di manipolazione e di imaging per lo studio delle interazioni proteina-DNA

Descriviamo una procedura per l'individuazione di elementi chimici presenti in situ in cellule umane, nonché la loro quantificazione in vitro . Il metodo è adatto a qualsiasi tipo di cellula ed è particolarmente utile per l'analisi chimiche quantitative in singole cellule in vitro esposizione di nanoparticelle di ossido di metallo.

In Situ Rilevazione e quantificazione di singola cellula delle nanoparticelle di ossido di metallo mediante analisi della microsonda del nucleare

Questo protocollo descrive un metodo per misurare sensibilmente il tasso di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule NSC-34 come motori neuronali quantificando il cambiamento in tempo reale nell'importazione nucleare di una proteina NLS-NES-GFP.

Analisi per misurare il trasporto nucleocitoplasmatico in tempo reale all&#39;interno di motori neuronici come le cellule NSC-34

Questo protocollo descrive un nuovo metodo che consente la visualizzazione quantitativa della formazione di complessi di proteine SNARE, basato sul trasferimento di energia per risonanza e la durata di fluorescenza imaging microscopia.

Visualizing intracellulare rullante traffico da fluorescenza Lifetime Imaging microscopia

Qui illustriamo come microscopia di localizzazione foto-attivata di singola molecola può essere effettuata sul terminale del nervo motore di un live Drosophila melanogaster terzo instar larva.

In Vivo Singola molecola Tracking al terminale presinaptico nervo motore Drosophila

Descriviamo i metodi di fotoattivazione della fluorescenza per analizzare il trasporto assonale dei neurofilamenti in assoni singoli mielinati di nervi periferici da topi transgenici che esprimono una proteina neurofilabile fotoattivabile.

Imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato

I metodi attuali descrivono un approccio non raziometrico per l'imaging subcompartimentale del calcio ad alta risoluzione in vivo in Caenorhabditis elegans utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati prontamente disponibili.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Questo protocollo descrive come impostare ed eseguire in modo efficiente analisi automatizzate dei dati di imaging di cellule vive ottenuti dal monitoraggio del trasporto nucleocitoplasmatico tramite strumenti optogenetici.

Utilizzo degli strumenti di optogenetica LEXY e LINuS e dell'analisi automatizzata delle immagini per quantificare le dinamiche di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule vive

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro efficiente per l'imaging microscopico di localizzazione a singola molecola di nuclei isolati di Arabidopsis, utilizzando isolamento, fissazione e marcatura ottimizzati per ottenere una visualizzazione affidabile su scala nanometrica della cromatina e della RNA Polimerasi II. Questo approccio può essere facilmente adattato ad altre proteine associate alla cromatina o modifiche agli istoni per immagini ad alta risoluzione.

Un protocollo semplificato per la microscopia di localizzazione a singola molecola nei nuclei di Arabidopsis

Funzione di proteine ​​della membrana è regolata dalla composizione lipidica della membrana cellulare. Questo video-articolo i dettagli come formare una patch usando elettrodi cerotto doppio strato, così come il modo di utilizzare i canali gramicidina come reporter di proprietà della membrana alterata.

Metodi di singola molecola per monitorare l&#39;evoluzione a doppio strato: Proprietà meccaniche

Scopri la microscopia a singola molecola per studiare il trasporto nucleare attraverso i pori nucleari nelle cellule HeLa. Questo metodo permette di analizzare la dinamica di importazione ed esportazione molecolare con alta risoluzione.

Singola molecola Imaging dei trasporti nucleari

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