Un sottile cranio Tecnica Finestra per cronica a due fotoni In vivo della microglia nei modelli murini di neuroinfiammazione

In pazienti adulti infetti da HIV, la neuroinfiammazione interferisce con la normale segnalazione sinaptica, provocando deficit neurocognitivi che includono difficoltà nell'astrazione, nella fluidità verbale, nell'attenzione, nell'apprendimento, nell'elaborazione di nuove informazioni e nella memoria. La proteina Tat di HIV-1 induce la secrezione di molecole infiammatorie, che possono mimare la disfunzione sinaptica osservata nei pazienti con HIV. Topi adulti che esprimono GFP in cellule mononucleate, inclusi i microglia, vengono utilizzati per studiare la neuroinfiammazione indotta da Tat di HIV-1 mediante microscopia a due fotoni con cranio sottile.

Le risposte delle microglia dopo l'iniezione di tat possono essere visualizzate in vivo. Le immagini ottenute mostrano l'accorciamento e l'ispessimento dei prolungamenti microgliali e la formazione di strutture simili a cupole fagocitiche, nonché il traffico di monociti periferici nei microvasi cerebrali. Ciao, sono Dan Marker del laboratorio di Harris Galbard e del Centro per lo Sviluppo Neurale e le Malattie Neurodegenerative presso l'Università di Rochester.

Ciao, sono EF Trombley del Laboratorio di Esca del Dipartimento di Neurobiologia e Anatomia dell'Università di Rochester. Ciao, sono Shain Luu, anch'io del Laboratorio Albas. Oggi vi mostreremo una procedura per l'imaging a due fotoni mediante una preparazione a cranio sottile.

Utilizziamo questa procedura per studiare l'infiammazione neurologica cronica. Cominciamo quindi con l'esperimento qui mostrato. Vengono utilizzati OT che esprimono GFP in linee cellulari mononucleari, inclusi i microglia.

È possibile utilizzare diverse ceppi di topi per soddisfare le esigenze di un progetto specifico. Iniziare a preparare un topo anestetizzato con fentanil e midazolam per un intervento chirurgico. Prima di tutto, assicurarsi che l'animale non risponda più a stimoli dolorosi, come una pinzatura della coda.

Posizionare l'animale su un tappetino riscaldante per prevenire l'ipotermia post-anestetica. Quindi coprire gli occhi dell'animale con un unguento oftalmico protettivo per mantenerli umidi. Tutti gli strumenti chirurgici devono essere stati sterilizzati in autoclave o con un sterilizzatore a perle di vetro; disinfettare ulteriormente gli strumenti immergendoli in etanolo al 70%.

Utilizzando delle forbici, rimuovere i peli dal cuoio capelluto dell'animale, quindi disinfettare la zona con una soluzione di iodopovidone al 10% e alcol al 70%. Iniziare l'intervento chirurgico utilizzando piccole forbici per praticare un'incisione mediana nel cuoio capelluto, partendo da quattro a cinque millimetri caudalmente rispetto al cranio e proseguendo in avanti fino all'area anteriore agli occhi. L'incisione dovrà essere sufficientemente lunga in modo che la pelle non interferisca con l'adesione della piastrina che stabilizza la testa del topo durante l'immagine a due fotoni.

Successivamente, applicare etanolo al 100% sul tampone di cotone sterile per asciugare le membrane sulla parte superiore del cranio. Rimuoverle delicatamente utilizzando pinzette fini. Se le membrane non vengono eliminate, l'attacco della piastra cranica sarà instabile.

Sotto una lente stereoscopica, identificare l'area da assottigliare. Evitare le aree di interesse localizzate direttamente sopra le suture craniche, poiché il cranio è meno stabile in queste zone e i vasi sanguigni e le meningi sottostanti potrebbero interferire con l'immagine trasmessa alla finestra di osservazione dell'area di interesse. Successivamente, utilizzando un bastoncino di cotone, provare nuovamente il cranio con una soluzione al 10% di cloruro ferrico.

Applicare uno strato sottile di colla perma bond, nove 10, attorno ai bordi della finestra di osservazione sotto la piastra cranica. Quindi posizionare la piastra sulla zona di interesse del cranio dell'animale esercitando una leggera pressione per far aderire la colla. Applicare una piccola quantità di acrilico attorno al bordo della finestra di osservazione utilizzando una siringa.

Infine, applicare una piccola quantità di Tite 4 54 ai bordi della finestra di osservazione per prevenire perdite. Avvitare la piastra cranica al supporto per l'animale e verificarne la stabilità al microscopio stereoscopico: sondando leggermente con una pinzetta, non deve verificarsi alcun movimento del cranio rispetto alla piastra.

Posizionare una goccia di soluzione salina sulla finestra di osservazione per assicurarsi che non ci siano perdite in preparazione della sottile incisione. Asciugare il cranio utilizzando una combinazione di bastoncini di cotone sterili e aria compressa. Assottigliare il cranio utilizzando una punta da trapano IRF 0 0 7 su un micro trapano.

A 4.000 giri/min. Iniziare molto delicatamente a assottigliare un'area circolare dal diametro di due a 2,5 millimetri. Utilizzare esclusivamente movimenti leggeri e ampi, quasi paralleli al cranio.

Non utilizzare pressione diretta verso il basso. Interrompere la perforazione ogni 20-30 secondi per rimuovere la polvere ossea mediante aria compressa. Queste pause durante la perforazione permettono al cranio di raffreddarsi, evitando danni termici al tessuto cerebrale sottostante.

Procedendo con la perforazione, osservare il passaggio allo strato osseo più umido e spinoso chiamato Diplo. Una volta raggiunto questo strato, esercitare particolare cautela con il trapano. Controllare occasionalmente lo spessore del cranio posizionando soluzione salina sulla zona sottile e osservando al microscopio stereoscopico.

La soluzione salina favorirà ulteriormente la dissipazione del calore. Man mano che il cranio viene assottigliato, diventano visibili vasi di dimensioni minori. Utilizzare una microlama dentale per ottenere l'assottigliamento finale sotto soluzione salina.

Il microbisturi fornisce un feedback tattile molto maggiore riguardo alla stabilità del cranio. Ciò consente preparazioni molto più sottili rispetto all'uso esclusivo del trapano. Lo spessore ottimale del cranio per l'acquisizione di immagini è compreso tra 10 e 30 micrometri.

L'intero processo di assottigliamento richiede normalmente tra 15 e 30 minuti. Verificare più volte lo spessore del cranio mediante fluorescenza episcopica durante la creazione di una finestra cranica sottile. La nitidezza e la profondità delle microglia e della vascolarizzazione visibili forniscono un'indicazione affidabile sul momento in cui la finestra è pronta per l'acquisizione di immagini.

Una volta che la finestra è pronta, utilizzare una pipetta di vetro con diametro di un millimetro per depositare una piccola goccia di colla acrilica Cy nell'area del cranio sottile e abbassare delicatamente un frammento di vetrino al suo interno. Quindi premere leggermente contro il cranio per espellere qualsiasi eccesso di colla, evitando la formazione di bolle tra il vetrino e la colla, che potrebbero ostacolare la visione. Dopo che la colla si è asciugata, utilizzare una micro-lama per rimuovere con attenzione qualsiasi residuo di colla presente sulla superficie superiore del vetrino, in preparazione all'immagine a due fotoni.

Coprire la finestra corticale del cranio sottile con soluzione salina e localizzare l'area di interesse mediante fluorescenza in epi. Per consentire successivi esami di imaging dell'area, acquisire un'immagine utilizzando una fotocamera per imaging. Qui viene mostrato un microscopio personalizzato a due fotocamere con un laser a ti-safiro regolato a 920 nanometri.

La fluorescenza viene rilevata utilizzando un fotomoltiplicatore o PMT in modalità di rilevamento su tutto il campo e un filtro di emissione 5 81 80. Viene utilizzata una lente a immersione in acqua 20x per tutta la sessione di acquisizione delle immagini. Impostare l'output massimo della potenza laser dell'obiettivo tra 50 e 65 milliwatt.

Successivamente, selezionare un'area di interesse, ovvero il primo o il secondo strato corticale fino a 150 micrometri al di sotto della superficie della pellicina. Per facilitare la reimaging, acquisire immagini dello stesso campo visivo con ingrandimento digitale 1x, 2x e 3x. I vasi sanguigni possono fungere da punti di riferimento per ritrovare facilmente lo stesso campo visivo durante le sessioni di imaging successive.

Con un ingrandimento di tre x, acquisire più Zacks con 80-90 passaggi Z ciascuno e un passo di 0,69 micrometri ogni cinque minuti per un massimo di 30 minuti. Ciò consente un buon campionamento della morfologia e del comportamento microgliale nel tempo tra le acquisizioni di Zacks; verificare il livello di soluzione salina e la profondità dell'anestesia. Se necessario, durante la procedura può essere somministrata una dose di richiamo pari a un terzo della dose originale del cocktail anestetico per prevenire la deposizione di tat sulla siringa e sull'ago durante i giorni precedenti l'iniezione.

Siliconizzare la parte interna di un ago da 35 gauge e di una siringa microvolume da 10 microlitri ritirando la soluzione di silanizzazione finché non riempie sia l'ago che la siringa. Lasciare riposare la soluzione per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi svuotare la soluzione dalla siringa, rimuovere lo stantuffo e lasciare asciugare completamente la siringa e l'ago. Infine, lavare accuratamente la siringa e l'ago con acqua deionizzata.

Dopo la silanizzazione, una siringa e un ago possono essere utilizzati per più di sei mesi prima che sia necessaria una nuova silanizzazione. Nel giorno dell'iniezione, posizionare una piccola goccia della soluzione di TAT su un vetrino di vetro silanizzato. Utilizzando una punta di pipetta silanizzata, caricare la quantità desiderata di soluzione nella siringa a volume microscopico a partire da questa goccia.

Utilizzando una punta da trapano, eseguire una piccola craniotomia di diametro pari a 0,5 millimetri, posizionata a tre millimetri in senso rostrale o laterale rispetto alla finestra corticale di cranio sottile dove sono state ottenute le immagini a due fotoni. A tale scopo, ridurre attentamente lo spessore del cranio. Successivamente, utilizzare una pinzetta affilata per rimuovere lo strato sottile di osso.

Utilizzare un micromanipolatore per allineare l'ago calibrato da 35 e la siringa con la craniotomia. Quindi avanzare con attenzione l'ago fino a una profondità compresa tra 700 e 900 micrometri al di sotto della superficie della pellicola. Iniettare tre microlitri a una velocità di 80 nanolitri al minuto utilizzando una pompa per siringa controllata da microprocessore.

Questa figura mostra microglia marcata con GFP visualizzata mediante imaging a due fotoni dopo l'implantazione della finestra corticale a cranio sottile, approssimativamente a 50 micrometri al di sotto della superficie della pellicola. Le singole sezioni a due fotoni acquisite al giorno zero, da 15 a 30 minuti dopo l'implantazione della finestra corticale a cranio sottile, così come quelle acquisite sette e 17 giorni dopo, dimostrano che le finestre rimangono trasparenti mentre la microglia permane attivata in assenza di insulti infiammatori. Ciò evidenzia l'utilità di questo metodo nello studio delle interazioni normali e infiammatorie tra cellule effettrici immunitarie e altri tipi cellulari neurali.

In vivo le proiezioni Z acquisite a sei e 24 ore dopo l'iniezione della neurotossina HIV TAT mostrano evidenti cambiamenti morfologici nei microglia attivati. Questo dimostra ulteriormente la nostra capacità di studiare in tempo reale i cambiamenti morfologici dei microglia in modelli acuti e cronici di neuroinfiammazione. Vi abbiamo appena mostrato come preparare una finestra nel cranio sottile e come utilizzarla per studiare la neuroinfiammazione durante l'esecuzione di questa procedura.

È importante ricordare di procedere con calma durante la manipolazione del cranio, per evitare danni causati dalla preparazione stessa. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.