Visualizzazione Cell-per-cell trasferimento del virus HIV usando cloni fluorescenti di HIV e Live Microscopia confocale

Questa procedura utilizza l'imaging di cellule vive per visualizzare il trasferimento di HIV marcato con GFP attraverso sinapsi virologiche tra cellule T CAT jerk che esprimono HIV e cellule T primarie non infette. Il test di trasferimento da cellula a cellula inizia con il sezionamento di cellule T CAT jerk con HIV gag IG FP, un clone fluorescente infettivo di HIV one, le cellule di gatto jerk trasfettate che esprimono HIV gag. Le IG FP vengono quindi miscelate con cellule T primarie non infette marcate con C-M-T-M-R e caricate in una camera di imaging dove si può osservare il trasferimento dell'HIV marcato con GFP attraverso la sinapsi virologica.

I dati risultanti vengono analizzati utilizzando un software di analisi delle immagini per rivelare i dettagli del trasferimento dell'HIV attraverso le sinapsi virologiche delle cellule T. Ciao, mi chiamo Benjamin Dale del laboratorio di Ben Chen nel Dipartimento di Medicina della Mount Sinai School of Medicine. Il mio nome è Greg McNerney sotto il laboratorio del Dr.Thomas Huser presso il NSF Center for Biophotonics presso l'uc Davis Medical Center.

E io sono Deanna Thompson, anche lei del laboratorio del Dr.Thomas Huser. Oggi vi mostreremo una procedura per visualizzare il trasferimento cellulare di cellule dell'HIV utilizzando la microscopia confocale dal vivo. In questa procedura, le cellule jerk hat vengono trasfettate con un clone molecolare infettivo dell'HIV solo personale di laboratorio addestrato che lavora in biosicurezza certificata.

Le sale di coltura tissutale di livello due plus o di livello tre di biosicurezza possono eseguire il protocollo mostrato qui. Lavorare con l'HIV infettivo nelle strutture di imaging deve essere approvato dall'ufficio istituzionale locale per la biosicurezza. Mantenere le cellule di gatto jerk da utilizzare come cellule donatrici a una concentrazione compresa tra due volte 10 e 10 volte 10 e 5 per millilitro.

Nella coltura del gatto jerk, una concentrazione di cellule medie superiore a otto volte 10 al quinto di cellule per millilitro determina una riduzione dell'efficienza trans. Per iniziare la procedura, trasfettare cinque volte 10 su sei cellule di gatto jerk con il plasmide virale, HIV gag IGFP Utilizzando il metodo di affezione nucleo amax come descritto nel protocollo scritto allegato, consentire alle cellule di riprendersi durante la notte. Le cellule mononucleate del sangue periferico vengono purificate da buffy coat di sangue umano intero mediante centrifugazione a gradiente di densità FICO.

Le quattro cellule T positive CD primarie vengono purificate dalle cellule mononucleate del sangue periferico mediante selezione negativa utilizzando un kit di isolamento delle cellule T CD quattro positive. Le quattro cellule T positive CD selezionate negativamente vengono raccolte da una colonna magnetica e coltivate nel nostro PMI con il 10% di FPS che viene integrato con 10 unità per millilitro di IL umano ricombinante, due si possono anche aliquotare le quattro cellule T positive CD primarie isolate e congelarle con l'aiuto di contenitori di congelamento criogenici. I contenitori di congelamento vengono posti in un congelatore a meno 70 gradi Celsius per un minimo di tre o quattro ore.

Le cellule vengono quindi trasferite in azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Ora che le cellule della testa jerk sono state trasfettate e le quattro cellule T positive del CD primario bersaglio sono state isolate, procedere alla pulizia e all'etichettatura delle cellule il giorno successivo alla trasfezione. Le cellule jerk stanno ora esprimendo il costrutto infettivo fluorescente dell'HIV.

Quando maneggiamo campioni infettivi, indossiamo un camice da laboratorio con chiusura frontale e due paia di guanti. Rimuovere i detriti cellulari dalle cellule trasfettate mediante centrifugazione su un terreno fial ad alta densità. Per prima cosa erogare 1,5 millilitri di confezione fial sul fondo di un tubo conico da 15 millilitri.

Quindi sovrapporre delicatamente il materiale sfumato con le celle jerk hat trasfettate in un volume di cinque millilitri del nostro mezzo PMI. A questo punto le cellule jerk hat trasfettate sono in grado di produrre HIV infettivo. Pertanto, tutti i puntali delle pipette che entrano in contatto con le cellule che esprimono l'HIV devono essere disinfettati con una soluzione di candeggina al 10%.

Prima di gettarla in un contenitore all'interno della camera di biosicurezza, tappare la provetta e spruzzare l'esterno della provetta con una soluzione di etanolo al 70% e pulire con una centrifuga a secco le cellule a 400 Gs per 20 minuti a temperatura ambiente con la rottura. Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta per rimuovere con cura le cellule dall'interfaccia fial del terreno e trasferire le cellule in una nuova provetta conica da 15 millilitri. Diluire le cellule con il nostro terreno PMI fino a un volume totale di 15 millilitri e centrifugare a 300 GS per 10 minuti.

A temperatura ambiente sospendiamo il pellet in tre millilitri di terreno di coltura jerk hat e trasferiamo in un pozzetto di due centimetri di una piastra a sei pozzetti. Posizionare la piastra nell'incubatore per colture tissutali fino al momento dell'uso il giorno successivo. La sera dello stesso giorno, etichettare le cellule T primarie CD, quattro cellule T positive utilizzate come cellule bersaglio per distinguerle dalle cellule del donatore: prima pellet quattro volte 10 delle sei cellule T positive CD primarie, ruotando a 400 Gs per 10 minuti.

Quindi lavare le cellule con cinque millilitri di PBS e Resus. Sospendere in due millilitri di PBS, aggiungere il tracker cellulare arancione a una concentrazione finale di 1,5 micromolari e incubare a 37 gradi Celsius per minuti. Quando le cellule hanno terminato l'incubazione, aggiungere otto millilitri di terreno chica completo e centrifugare a 400 g per 10 minuti.

Risospendere le cellule in tre millilitri di terreno completo integrato con 10 unità per millilitro di IL due e metterle nell'incubatore di coltura tissutale per una notte. Dopo l'incubazione notturna, il donatore e le cellule bersaglio sono pronti per l'esperimento di trasferimento da cellula a cellula. Prima di impostare l'esperimento di trasferimento da cella a cellula, preparare la camera di imaging per tamponare la piattaforma contro le fluttuazioni di temperatura nella stanza.

E per bloccare la luce di fondo della stanza, una grande copertura nera è drappeggiata su tutta la configurazione termica del microscopio, creando una sacca d'aria isolata attorno al sistema. La camera di imaging viene mantenuta a una temperatura stabile di 37 gradi Celsius utilizzando un riscaldatore termostatico con una punta della termocoppia di tipo T posizionata accanto al campione per il feedback della temperatura. Preriscaldare per 30 minuti prima di montare il campione.

L'imaging confocale a disco rotante con un microscopio ottico invertito viene utilizzato per creare immagini confocali 3D del trasferimento da cellula a cellula dell'HIV. Tutto l'hardware e l'acquisizione, compreso uno stadio Z, sono controllati dal software e o IQ versione 1.8 La scansione viene eseguita da un'unità confocale a disco rotante CS U 10 che utilizza contemporaneamente più di 800 punti confocali per aumentare notevolmente la velocità di scansione per completare la sua velocità. Il CS U 10 è abbinato a una fotocamera del dispositivo accoppiato carbonizzato a moltiplicazione di elettroni altamente sensibile per consentire un imaging rapido in condizioni di scarsa illuminazione, che riduce sia il fotobleaching che la fototossicità.

La sorgente di luce a fluorescenza è un laser a gas a ioni argon kripton, multi lunghezza d'onda. Un filtro ottico sintonizzabile e/o Oko o un OTF viene utilizzato per selezionare le lunghezze d'onda desiderate, che qui sono 488 nanometri e 568 nanometri, controllando la loro potenza per ridurre ulteriormente il fotobleaching e prolungare il tempo di imaging. L'A OTF scatta rapidamente il laser dopo ogni esposizione da 15 a 30 millisecondi quando la fotocamera non sta acquisendo immagini, evitando esposizioni non necessarie mentre le immagini vengono trasferite dalla fotocamera E-M-C-C-D al computer.

La luce laser è incorporata nel sistema a disco rotante utilizzando un 4 0 5 4 88 5 68 6 47 quad band L'emissione fluorescente dicroica è separata dalla lunghezza d'onda utilizzando uno specchio diico lungo 560 nanometri con un divisore di immagini. Il canale verde viene filtrato utilizzando un filtro passa banda 525 oltre 50 nanometri e il canale rosso viene filtrato utilizzando un filtro passa banda 609 oltre 54 nanometri. I due canali vengono proiettati fianco a fianco sulla telecamera E-M-C-C-D.

Mentre la camera di imaging si sta riscaldando, preparare le cellule per l'esperimento di trasferimento da cellula a cellula. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule ette che esprimono IGFP gag HIV. Posizionare l'emocitometro in una capsula di Petri per evitare l'esposizione diretta alle cellule che esprimono il virus.

Lavare le cellule con anidride carbonica, terreni indipendenti e risospendere in terreni di imaging su cellule vive a una concentrazione da una a tre volte 10 delle sette cellule per millilitro. L'uso di mezzi indipendenti dall'anidride carbonica elimina la necessità di una camera ambientale per l'anidride carbonica. Per l'imaging.

Le cellule contano, lavano e riprospendono anche le quattro cellule T positive CD primarie marcate, come appena mostrato per le cellule jerk hat. Successivamente, iniziare il trasferimento da cellula a cellula, mescolare 20 microlitri di cellule dur hat trasfettate IGFP gag HIV con 40 microlitri di cellule T positive CD primarie marcate e caricare 50 microlitri in una coltura tissutale trattata con gas permeabile. La micro camera EBD sigilla la camera con i tappi e fissa i tappi avvolgendo l'interfaccia della camera EBIT D del tappo con la paraforma.

Pulire la camera di imaging con una salvietta chimica condita con etanolo al 70% e lasciarla asciugare brevemente all'aria nel cappuccio. Trasportare la camera di imaging sigillata in un contenitore sigillato per evitare l'esposizione accidentale. Se la camera dovesse cadere durante il trasporto subito dopo aver caricato la camera di imaging IBD con le cellule, montare il dispositivo sul microscopio.

Scatta immagini di coppie di celle utilizzando un obiettivo a immersione in olio 60 x 1,42 NA Poiché l'elevata apertura numerica migliora notevolmente la risoluzione per massimizzare la velocità di acquisizione per pile di immagini 3D. Ritagliare la regione di registrazione della fotocamera del CD EM fino all'area immediata di una coppia di celle. Inoltre, un ampio passo Z compreso tra 0,45 e 0,75 micrometri può anche aiutare a velocizzare l'acquisizione in queste condizioni.

Le immagini vengono registrate in modo continuo a intervalli di 20-60 minuti. L'imaging ripetuto dello stesso punto campione può estendersi fino a sei ore con un minimo sbiancamento della foto una volta acquisito. Ogni segmento di dati è composto da decine di migliaia di immagini che possono occupare un totale da cinque a 20 gigabyte.

Per facilitare il trasporto e l'analisi dei file di grandi dimensioni, ogni file viene suddiviso ed esportato come segmenti di file immagine TIFF da un gigabyte. Per analizzare le immagini acquisite, utilizzare uno dei diversi programmi software di analisi delle immagini. Consultare il protocollo scritto allegato per i dettagli sull'analisi dell'immagine, inclusa la correzione dell'intensità dello sbiancamento e il tracciamento automatico e manuale dei punti gag.

Entro 10-15 minuti dalla miscelazione, è possibile visualizzare le cellule di gatto jerk che esprimono IGFP che esprimono HIV che aderiscono all'imaging primario delle quattro cellule T positive del CD. Questi coniugati consentono di valutare i movimenti dei punti gag nelle cellule infette e nelle cellule bersaglio. Dopo la sinapsi, entro 30 minuti o tre ore, si può osservare il movimento dei punti IG FP gag nelle cellule bersaglio che sono marcate con il tracker cellulare.

Vi abbiamo appena mostrato come visualizzare il trasferimento da cellula a cellula dell'HIV tra le cellule T. Quando si eseguono queste procedure, è molto importante ricordare di osservare tutte le precauzioni di biosicurezza di livello due più o tre quando si maneggiano campioni che sono stati esposti a cellule che esprimono l'HIV. Ricorda anche di utilizzare cellule JCA ben conservate e DNA privo di endotossine per ottimizzare il trasfetto.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.