Name: Visualizzazione Cell-per-cell trasferimento del virus HIV usando cloni fluorescenti di HIV e Live Microscopia confocale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Scopri la visualizzazione del trasferimento cellula-cellula dell'HIV usando cloni fluorescenti e microscopia confocale live. Questo metodo permette di studiare la trasmissione virale attraverso sinapsi virologiche tra cellule T.

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Questo esame è stato sostenuto dal National Institutes of concede sanità, AI074420-02, Investigator Award Burroughs Wellcome, Hirschl Scientist Award della carriera per BKC e dal Centro NSF per Biofotonica Scienza e Tecnologia, accordo Cooperativa PHY012099, e un premio Salute UCD sistema di ricerca per TH UCD CTSC NCRR ULRR024146.

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">Hübner et al Science 323:. 1743-1747 (2009)</a> . 1. Panoramica Cellula-cellula diffusione del virus HIV è stato originariamente descritto utilizzando cellule Jurkat infette da HIV, come cellule del donatore e CD4 + linfociti T primari come cellule accettore 1,2,3. In questi studi, il virus è stato individuato nelle cellule fissate con colorazione degli anticorpi. Per tracciare il trasferimento del virus da cellula a cellula in cellule vive, abbiamo sfruttare una ricombinante, clone molecolare infettivo dell&#39;HIV chiamato HIV Gag-iGFP 4. Essa svolge la proteina verde fluorescente (GFP) inserito internamente nella proteina Gag tra i domini MA e CA. Questo clone molecolare di HIV mantiene infettività senza la necessità di virus helper. Particelle virali fatto da questo clone stechiometricamente sono caricati con una proteina fluorescente verde, fornendo un forte segnale di fluorescenza per il monitoraggio di assemblaggio virale e il trasferimento tra le cellule. Quando utilizzato in combinazione con inerti cellula-tracking coloranti fluorescenti, le cellule destinatario può essere discriminato dalle cellule del donatore di input, e permettendo di visualizzare il trasferimento del virus da una cellula T infetto a una cellula T non infetti 5. Formazione di sinapsi virologici e il trasferimento del virus da una cellula all&#39;altra può essere osservata nelle cellule viventi mentre sono coltivate in un contenitore sigillato, gas-permeabili camera di imaging. (Giorno 1) 2. Preparazione di HIV Gag-iGFP transfettati cellule T Jurkat <ol><li> Preparare il CD4 umano + T linea cellulare Jurkat (ATCC, Manassas, VA) con cura mantenendo le cellule ad una concentrazione tra 2 x x 10 5 e 8 10 5 cellule / ml in Jurkat cultura dei media (RPMI 1640, 10% di siero fetale bovino, 100 unità / ml penicillina e 100 mg / ml streptomicina). La chiave del successo: la cultura delle cellule Jurkat a concentrazioni superiori a 8 x 10 5 cellule / ml si tradurrà in una riduzione di efficienza di trasfezione. Nota: La transfezione Gag di HIV-iGFP DNA provirale nelle cellule T, come descritto di seguito, i risultati nella produzione di una capaci di replicazione del virus dell&#39;immunodeficienza umana. Come tale, tutte le operazioni dovranno essere effettuate esclusivamente da personale addestrato in laboratorio certificato livello di biosicurezza 2 + o biosicurezza di livello 3 (BL2 + / BL3) camere colture di tessuti. Lavora con infettivo nelle strutture di imaging deve essere approvata dal vostro ufficio locale istituzionali biosicurezza. </li><li> Trasfezione le Jurkats con il plasmide virale, l&#39;HIV Gag-iGFP con il metodo nucleofection Amaxa (Lonza, Walkersville, MD). Pellet 5 x 10 6 cellule per centrifugazione per 10 min a 150 x g. Aspirare il surnatante e lavare le cellule in soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS). Centrifugare le cellule e risospendere il pellet a 97 ml di pre-riscaldato, V soluzione nucleofector contenente supplemento del produttore. Aggiungere tre ml di endotossina libero HIV Gag-iGFP plasmide (1 mg / mL) alla sospensione cellulare e mescolare delicatamente. Trasferire la sospensione cellulare ad una cuvetta e nucleofect utilizzando il programma S-18. Trasferire immediatamente le cellule a 3 ml di media cultura preriscaldata Jurkat senza antibiotici. </li><li> Per preparare cellule CD4 + obiettivo per sinapsi virologica, si ottengono cellule mononucleari del sangue periferico da buffy cappotti usando uno standard di Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Svezia) il protocollo. Cellule T CD4 + sono poi negativamente selezionati utilizzando un kit magnetico isolamento tallone (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Questi possono essere memorizzati in criogenicamente N2 liquido in aliquote di 5 x 10 6 cells/500 l di mezzi di congelamento (90% fetale bovino DMSO serum/10%). Scongelati CD4 + primaria cellule T sono coltivate in RPMI 10% FBS, integrata con 10 unità / ml di IL-2. </li></ol> (Giorno 2) 3. Recupero di cellule vive da Jurkats transfettati con l&#39;HIV Gag-iGFP e colorazione delle cellule bersaglio con tinture fluorescenti <ol><li> Consentire alle cellule Jurkat a riprendersi dalla transfezione durante la notte. Quindi rimuovere i detriti cellulari per centrifugazione su un gradiente di materiale Hypaque Ficoll densità. Dispensare 1,5 ml di Ficoll-Paque al fondo di un tubo da 15 ml. Delicatamente sovrapposizione questo materiale con il gradiente Jurkats transfettate in un volume di 5 ml di RPMI. Centrifugare le cellule a 400 xg per 20 minuti a temperatura ambiente con il freno. Rimuovere con attenzione le cellule da parte dei media / Ficoll interfaccia utilizzando una pipetta. Trasferirli in un nuovo tubo 15 ml. Diluire le cellule con RMPI ad un volume totale di 15 ml e centrifugare a 300 xg per 10 min. Risospendere il pellet in 3 ml di terreni di coltura Jurkat in ben 2 centimetri (6-pozzetti) e ritornare le cellule al tessuto culturale incubatore. </li><li> Per distinguere le cellule bersaglio dalle cellule del donatore nella cellula-cellula esperimenti di trasferimento abbiamo prelabel le cellule CD4 + bersaglio con coloranti fluorescenti. Primario delle cellule CD4 + T sono contrassegnati anche l&#39;zione prima dell&#39;uso. Abbiamo avuto ottimi cellule T successo etichettatura sia con CellTracker e coloranti CellTrace (Invitrogen, Carlsbad, CA). Mentre la concentrazione di colorante e tempi di incubazione devono essere ottimizzati a seconda del colorante particolare tipo di cellule, un protocollo di rappresentante segue. Pellet di 4 x 10 6 cellule CD4 + T primarie facendo girare a 400 xg per 10 min. Lavare le cellule con 5 ml di PBS e risospendere in 2 ml di PBS. Aggiungi CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) ad una concentrazione finale di 1,5 mM e incubare a 37 ° C per 20 min. Aggiungere 8 ml di media Jurkat completo e centrifugare a 400 xg per 10 min. Risospendere le cellule in 3 ml di mezzi di comunicazione completo integrato con 10 unità / ml di IL-2 e il luogo nel tessuto della cultura incubatore durante la notte. </li></ol> (Giorno 3) 4. Monitoraggio Cell-per-cell trasferimento di HIV Gag-iGFP dell&#39;immagine in tempo reale utilizzando cellule Noi abitualmente uso HIV Gag-iGFP cellule Jurkat trasfettate 48 ore dopo la trasfezione. Tuttavia, abbiamo utilizzato con successo le cellule già da 24 ore, e non più tardi di 72 ore dopo la trasfezione. <ol><li> Circa 48 ore dopo la trasfezione, HIV Gag-iGFP Jurkats esprimono sono contati, lavati con CO 2-media indipendenti (Invitrogen, Carlsbad, CA), e risospesi in vivo delle cellule e pubblicitario (CO 2 media indipendenti, il 10% siero fetale bovino, 100 U / ml penicillina e 100 mg / ml streptomicina, 10 unità / mL di IL-2) ad una concentrazione di 1-3 x 10 7 cellule / ml. </li><li> In modo simile, lavare e risospendere etichettato CD4 + primaria cellule T ad una concentrazione di 1-3 x 10 7 cellule / ml in live media di imaging cellulare. </li><li> Mix HIV Gag-iGFP transfettate Jurkats con CD4 + linfociti T primari con un rapporto 1:2 o 1:3 e caricare in una cultura tessuto trattato, gas permeabili, microchamber (Ibidi, Verona, WI). Per esempio, mix 20 ml di HIV-Gag iGFP Jurkats transfettate con 40 ml di etichettate CD4 + linfociti T primari. Carico di 50 ml di questa miscela in una camera Ibidi e sigillare la camera con spine. Fissare le spine avvolgendo la spina / interfaccia camera Ibidi con parafilm. </li></ol> 5. Considerazioni per le piattaforme di microscopia: disco rotante di imaging confocale Dopo aver caricato una camera di imaging Ibidi con le cellule, abbiamo immediatamente montare il dispositivo su un microscopio ottico invertito (iX71 Olympus, Center Valley, PA). La camera Ibidi dovrebbe essere trasferito al microscopio solo BL2 + personale qualificato laboratorio di indossare indumenti appropriati. Anche se vivo a celle di imaging utilizza comunemente camere di incubazione costosi da mantenere un ambiente stabile a 37 ° C, questo è stato realizzato utilizzando un calorifero semplice ed economico termostatica (ASI 400, Nevtek, Williamsville VA) insieme a una di tipo T punta della termocoppia montato accanto al il campione di feedback temperatura corretta. Abbiamo trovato con CO 2-media indipendenti ci permette di mantenere alta la vitalità delle cellule, evitando l&#39;uso di una camera di CO 2. Per attenuare gli piattaforma contro le fluttuazioni di temperatura nella stanza e per bloccare Sala luce di fondo, un grande velo nero è drappeggiato su tutto il microscopio / riscaldatore configurazione creando una sacca d&#39;aria isolante intorno al sistema. Questo riduce notevolmente variazione di temperatura e di temperatura associati legati deriva campione, ma necessita di pre-riscaldamento per 30 minuti prima del montaggio del campione. 6. Acquisizione dati, trasferimento e Image Processing Le immagini sono prese utilizzando un obiettivo 60x 1,42 olio NA immersione (UPlanApo N, Olympus), come l&#39;apertura ad alta numerica (NA) migliora notevolmente la risoluzione. Per creare immagini 3D confocale, la scansione viene eseguita da un&#39;unità disco rotante confocale (CSU-10, Yokagawa, Giappone) che utilizza contemporaneamente&gt; 800 punti confocale di aumentare notevolmente la velocità di scansione. Per completare la sua velocità, la CSU-10 è accoppiato con un elevata sensibilità elettroni moltiplicando charged-coupled device (EMCCD, ixon + 897, Tecnologie Andor, Irlanda) fotocamera per consentire veloci, di immagini a bassa luce che riduce sia photobleaching e fototossicità. La sorgente luminosa a fluorescenza è un multi-lunghezza d&#39;onda ARKR agli ioni di gas di laser (Innova 70C, Coherent, Santa Clara), dove la lunghezza d&#39;onda desiderata (488 nm) e la potenza del laser misurata a destra prima l&#39;obiettivo microscopio (&lt;1 mW) vengono selezionati da un acusto- filtro ottico sintonizzabile (AOTF), (Tecnologie Andor). Per ridurre ulteriormente photobleaching ed estendere il tempo totale di imaging, il AOTF rapidamente (microsecondi) si spegne il fascio laser ogni volta che la fotocamera è attiva (10-20 ms), mentre l&#39;immagine appena acquisita viene consegnato dal CCD (15-30 esposizione ms) al computer. La luce laser viene accoppiato al sistema utilizzando un disco rotante quad 405/488/568/647 banda specchio dicroico (Semrock, Rochester, NY). Emissione di fluorescenza viene filtrato con un filtro passa-banda 525/50 (Semrock) all&#39;interno di una ruota portafiltri (Ludl prodotti elettronici, Hawthorne, NY) montato bra la fotocamera EMCCD e l&#39;unità confocale disco rotante. Tutto l&#39;hardware e l&#39;acquisizione, tra cui un z-stadio (Mad Labs Città, Madison, WI), sono controllati dalla iQ Andor v1.8 software. Per massimizzare la velocità di acquisizione a circa 1,2-1,9 stack seconda immagine 3D, si taglia la zona di registrazione della fotocamera del EMCCD è scesi a immediate vicinanze della cellula-coppia. Inoltre, a scapito di qualche informazione in z, z-un grande passo tra 0,45-0,75 micron può essere usato per velocizzare l&#39;acquisizione. Imaging in queste condizioni può durare fino a 6 ore - con continuo segmenti 20-60 minuti - con photobleaching minima. Complessivamente, ogni segmento di dati occupa tipicamente 5-20 Gb di spazio, come decine di migliaia di immagini sono tratte. Per facilitare il trasporto e l&#39;analisi dei file di dati di grandi dimensioni, ogni set di acquisizione deve essere scomposto e esportati come 1 Gb segmenti di file immagine TIFF utilizzando il software v1.8 Andor iQ. Da qui, molti pacchetti software eccellenti sono disponibili per l&#39;analisi delle immagini, come ad esempio Metamorph, Volocity e ImageJ (si consiglia la sua variazione Figi). Quando due marcatori fluorescenti devono essere monitorati, abbiamo registrare simultaneamente entrambi senza rallentare l&#39;acquisizione utilizzando una &quot;modalità split screen.&quot; Entrambi i marcatori sono eccitati da due diverse linee laser ARKR in una sola volta (spesso 488 e 568 nm). Inseriti direttamente prima che la fotocamera EMCCD è un&#39;immagine splitter (OptoSplit II, Cairn, Kent, UK) che separa le due immagini diverse. Ogni immagine viene poi filtrata in modo indipendente con filtri a fluorescenza (Semrock) e proiettate fianco a fianco la fotocamera in una sola volta creando l&#39;effetto &quot;split-screen&quot;. Questo sarebbe poi richiedere il ritaglio manuale e l&#39;allineamento delle immagini più avanti in elaborazione delle immagini. 7. Considerazioni per la elaborazione delle immagini e analisi dei dati Noi di solito effettuare analisi di immagine con Volocity (PerkinElmer, Waltham, MA) su computer Macintosh (Apple, Inc). Disco rotante immagini di microscopia laser confocale vengono prima corretti per la loro intensità per correggere photobleaching, poi deconvolved con Volocity. Misure di intensità e il monitoraggio di puncta Gag è effettuata con il modulo Quantificazione Volocity. Per i set di immagini in cui il movimento relativo ad un pre-formata sinapsi deve essere calcolato, un algoritmo di tracciamento automatico è impiegata che segue il pulsante sinaptica durante l&#39;intera sequenza. Ispezione manuale di regioni di interesse definito dal software autotracking deve essere eseguito per confermare che il software è correttamente rintracciato l&#39;oggetto desiderato. Per gli oggetti in cui il contrasto con gli oggetti circostanti è troppo debole, il tracking manuale può essere eseguita su un fotogramma per fotogramma. Il pacchetto software Volocity permette l&#39;esportazione di posizione XYZ, volume e segnale integrato all&#39;interno gli oggetti desiderati. La distanza dalla sinapsi e la velocità dell&#39;oggetto monitorati sono calcolati normalizzando i movimenti al centro del bottone sinaptico. 8. Rappresentante Risultati Entro 10 a 15 minuti di miscelazione si dovrebbe essere in grado di visualizzare l&#39;HIV Gag-iGFP cellule Jurkat che esprimono aderenti al CD4 + linfociti T primari. Imaging questi coniugati, si possano valutare i movimenti di puncta Gag nelle cellule infette e nelle cellule bersaglio dopo synaspe. Si può osservare il movimento di Gag-iGFP puncta all&#39;interno delle cellule bersaglio poco dopo la sinapsi si formano.

<ol><li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li>
<li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent%2C+fluorescently+tagged+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Descriviamo qui un metodo semplice per visualizzare il trasferimento del virus da cellula-cellula. Una recente ricerca del nostro laboratorio e altri &#39;suggerisce che ciò potrebbe essere la modalità prevalente di diffusione dell&#39;HIV tra le cellule T. Il metodo qui descritto utilizza una forma ricombinante del virus HIV, chiamato HIV Gag-iGFP che veicola una geneticamente codificato tag proteina fluorescente verde nel centro della proteina strutturale, Gag. A causa degli elevati livelli di GFP prodotto in ogni particella del virus, questo clone capaci di replicazione dell&#39;HIV consente ai ricercatori di tracciare le particelle del virus individuali in tempo reale. Questo virus dovrebbe essere particolarmente utile negli studi riguardanti il ​​trasferimento di montaggio e cellula-cellula del virus HIV. Il trasferimento del virus HIV da cellula-cellula di trasferimento è altamente efficiente. Nel corso di una tre ore di co-cultura, di routine vedere virus trasferiti al 20-30% di cellule primarie T come valutato mediante citometria di flusso. Efficienze simili sono qualitativamente visto durante l&#39;imaging cellulare dal vivo. Virale infetta le cellule T iniziare formando sinapsi con le cellule non infette primarie T quasi immediatamente dopo l&#39;inizio della co-coltura. Interessante, non tutte le cellule primarie T sono in grado di interagire con infezione da HIV cellule Jurkat nonostante le interazioni forzata con pinzette laser (osservazioni non pubblicate, GM). Gag di HIV-iGFP sarà senza dubbio utile per determinare sottoinsiemi di cellule T che sono più suscettibili di cellula-cellula trasferimento, sia in vitro che in vivo.

<table><tbody><tr><td>Cellule T Jurkat</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strati leucocitari da sangue intero</td><td>New York Blood Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino fetale</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema Nucleofector e Soluzione V</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit EndoFree Maxi Prep</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmide HIV Gag-iGFP</td><td>Chen Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit per l'isolamento di cellule T CD4+</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coloranti Celltracker/CellTrace</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezzi indipendenti dal CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camere per imaging</td><td>Ibidi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito Olympus IX-71</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo ad olio PlanApo N 1.42NA 60X</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser a gas ionico Innova 70C ArKr</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unità confocale a disco rotante di tipo Nipkow CSU-10</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beamsplitter dicromatico Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro passa-banda 525/50</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera a dispositivo accoppiato a carica ad moltiplicazione elettronica iXon+ 897</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Riscaldatore termostatico ASI 400</td><td>Nevtek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizzazione cell-per-cell trasferimento del virus hiv usando cloni fluorescenti di hiv e live microscopia confocale

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Fondendo la proteina fluorescente verde a loro proteine ​​preferiti, i biologi hanno ora la possibilità di studiare viventi complessi processi cellulari utilizzando la microscopia a fluorescenza video. Per seguire i movimenti della proteina del virus di immunodeficienza umana nucleo durante cellula-cellula trasmissione del virus dell&#39;immunodeficienza umana, abbiamo GFP-tagged la proteina Gag nel contesto di un clone molecolare infettivo dell&#39;HIV, chiamato HIV Gag-iGFP. Studiamo questo clone virale usando la microscopia confocale video. Nel seguente esperimento visualizzate, abbiamo trasfettare un essere umano linea di cellule T con l&#39;HIV Gag-iGFP, e usiamo fluorescente + CD4 non infetti le cellule T di servire come cellule bersaglio per il virus. Utilizzando le etichette diverse fluorescenti si può facilmente seguire la produzione virale e il trasporto attraverso le strutture intracellulari chiamati sinapsi virologica. Semplice gas permeabili camere di imaging ci permettono di osservare dal vivo le sinapsi con microscopia confocale da minuti a giorni. Questi approcci possono essere usati per tracciare proteine ​​virali che si muovono in da una cellula all&#39;altra.

Questo esperimento viene visualizzata una guida per l&#39;utilizzo fluorescente un clone molecolare di HIV per vivere esperimenti di imaging confocale.

Visualizzazione Cell-per-cell trasferimento del virus HIV usando cloni fluorescenti di HIV e Live Microscopia confocale

Fondendo la proteina fluorescente verde con le proprie proteine d'interesse, i biologi hanno ora la possibilità di studiare processi cellulari complessi in vivo utilizzando...

Questa procedura utilizza l'immagineggiamento di cellule vive per visualizzare il trasferimento di HIV marcato con GFP attraverso le sinapsi virologiche tra cellule T jerk CAT che esprimono HIV e cellule T primarie non infette. Il saggio di trasferimento da cellula a cellula inizia con la trasfezione delle cellule T jerk CAT con HIV gag IG FP, un clone fluorescente infettivo di HIV-1; le cellule jerk CAT transfezionate che esprimono HIV gag IG FP vengono quindi mescolate con cellule T primarie non infette marcate con C-M-T-M-R e caricate in una camera per immagini in cui può essere osservato il trasferimento di HIV marcato con GFP attraverso la sinapsi virologica.I dati ottenuti vengono analizzati utilizzando un software di analisi delle immagini per rivelare i dettagli del trasferimento dell'HIV attraverso le sinapsi virologiche delle cellule T. Ciao, mi chiamo Benjamin Dale, del laboratorio di Ben Chen del Dipartimento di Medicina della Mount Sinai School of Medicine. Il mio nome è Greg McNerney, del laboratorio del Dott. Thomas Huser presso il Centro NSF per la Biopotonica del centro medico dell'uc Davis.E io sono Deanna Thompson, anch'io del laboratorio del Dott. Thomas Huser. Oggi vi mostreremo un procedimento per visualizzare il trasferimento cellulare di HIV-1 mediante microscopia confocale in tempo reale. In questo procedimento, le cellule Jurkat vengono trasfettate con un clone molecolare infettivo di HIV, esclusivamente da personale di laboratorio qualificato che opera in condizioni di biosicurezza certificate.Le camere di coltura cellulare di livello due più o di livello di sicurezza biologica tre possono eseguire il protocollo qui mostrato. Il lavoro con HIV infettivo in strutture per l'imaging deve essere approvato dall'ufficio locale di sicurezza biologica dell'istituto. Mantenere le cellule jerk cat da utilizzare come cellule donatrici a una concentrazione compresa tra due volte 10 alla quinta e otto volte 10 alla quinta cellule per millilitro.Nella coltura di cellule di gatto jerk, una concentrazione cellulare superiore a otto volte 10 alla quinta cellule per millilitro provoca una riduzione dell'efficienza di trasduzione. Per iniziare la procedura, trasfettare cinque volte 10 alla sesta cellule di gatto jerk con il plasmide virale HIV gag IGFP utilizzando il metodo di nucleofezione amax come descritto nel protocollo scritto allegato, quindi lasciare riposare le cellule per tutta la notte. I linfociti mononucleati del sangue periferico vengono purificati da strati buffy di sangue umano intero mediante centrifugazione su gradiente di densità FICO.I linfociti T CD4 positivi primari vengono purificati dai globuli bianchi mononucleati del sangue periferico mediante selezione negativa utilizzando un kit di isolamento per linfociti T CD4 positivi. I linfociti T CD4 positivi ottenuti per selezione negativa vengono raccolti da una colonna magnetica e coltivati nel nostro mezzo PMI con il 10% di FPS, integrato con 10 unità per millilitro di IL-2 ricombinante umana. È inoltre possibile suddividere in aliquote i linfociti T CD4 positivi primari isolati e congelarli avvalendosi di contenitori criogenici. I contenitori vengono collocati in un congelatore a meno 70 gradi Celsius per un periodo minimo di tre-quattro ore.Le cellule vengono quindi trasferite nell'azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Ora che le cellule jerk head sono state trasfettate e le cellule T primarie bersaglio CD4 positive sono state isolate, procedere alla purificazione e all'etichettatura delle cellule nel giorno successivo alla trasfezione. Le cellule jerk esprimono ora il costrutto infettivo di HIV fluorescente.Quando si manipolano campioni infettivi, indossiamo un camice da laboratorio con chiusura anteriore e due paia di guanti. Rimuovere i detriti cellulari dalle cellule transfezionate mediante centrifugazione su un mezzo con alta densità di pacchetti fial. Prima, dispensare 1,5 millilitri di fial pack sul fondo di un tubo conico da 15 millilitri.Quindi, sovrapporre delicatamente il materiale a gradiente con le cellule transfettate jerk hat in un volume di cinque millilitri del nostro mezzo PMI. A questo punto, le cellule transfettate jerk hat sono in grado di produrre HIV infettivo. Pertanto, tutte le punte di pipetta che vengono a contatto con le cellule esprimenti HIV devono essere disinfettate con una soluzione di candeggina al 10%.Prima di smaltire in un contenitore all'interno della cappa a sicurezza biologica, chiudere il tubo con il tappo e spruzzare l'esterno del tubo con una soluzione di etanolo al 70%, quindi asciugare con un fazzoletto di carta kim. Centrifugare le cellule a 400 G per 20 minuti a temperatura ambiente con la frenata disattivata. Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta per rimuovere con attenzione le cellule dall'interfaccia con il mezzo e trasferire le cellule in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Diluire le cellule con il nostro mezzo PMI fino a un volume totale di 15 millilitri e centrifugare a 300 G per 10 minuti.A temperatura ambiente, sospenderemo il pellet in tre millilitri di mezzo di coltura jerk hat e trasferiremo in una pozzetta da due centimetri di una piastra a sei pozzetti. Posizionare la piastra nell'incubatrice per colture cellulari fino al momento dell'utilizzo, previsto per il giorno successivo. Nella serata dello stesso giorno, etichettare le cellule T primarie CD4 positive utilizzate come cellule bersaglio, al fine di distinguerle dalle cellule del donatore. Pellettare quattro volte 10 alla sesta cellule T primarie CD4 positive centrifugando a 400 ×g per 10 minuti.Quindi lavare le cellule con cinque millilitri di PBS e risospendere in due millilitri di PBS, aggiungere il colorante orange per il tracciamento cellulare a una concentrazione finale di 1,5 micromolare e incubare a 37 gradi Celsius per minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere otto millilitri di mezzo CHICA completo e centrifugare a 400 G per 10 minuti.Risospendere le cellule in tre millilitri di terreno completo integrato con 10 unità per millilitro di IL-2 e collocare nell'incubatore per colture cellulari durante la notte. Al termine dell'incubazione notturna, le cellule donatrici e le cellule bersaglio sono pronte per l'esperimento di trasferimento da cellula a cellula. Prima di allestire l'esperimento di trasferimento da cellula a cellula, preparare la camera per imaging per attenuare le fluttuazioni di temperatura nell'ambiente.Per eliminare la luce ambientale di fondo, un ampio telo nero viene posizionato sopra l'intero sistema di riscaldamento del microscopio, creando una camera d'aria isolante intorno al sistema. La camera di imaging viene mantenuta a una temperatura stabile di 37 gradi Celsius mediante un riscaldatore termostatico dotato di una sonda termocoppia di tipo T posizionata accanto al campione per il controllo della temperatura. Riscaldare in anticipo per 30 minuti prima di montare il campione.L'imaging confocale a disco rotante con microscopio ottico invertito viene utilizzato per creare immagini confocali tridimensionali del trasferimento di HIV da cellula a cellula. Tutti i componenti hardware e l'acquisizione, inclusa la piattaforma Z, sono controllati dal software Andor IQ versione 1.8. La scansione viene eseguita da un'unità confocale a disco rotante CSU-10 che utilizza contemporaneamente più di 800 punti confocali, aumentando notevolmente la velocità di scansione per sfruttarne al meglio la rapidità. Il CSU-10 è abbinato a una camera altamente sensibile a moltiplicazione elettronica CCD, che consente l'imaging rapido in condizioni di scarsa illuminazione, riducendo così sia il fotobiancamento sia la fototossicità.La sorgente luminosa a fluorescenza è un laser a gas ad ioni di argon e cripto multifrequenza. Un filtro ottico accordabile And or Oko o A OTF viene utilizzato per selezionare le lunghezze d'onda desiderate, che in questo caso sono 488 nanometri e 568 nanometri, controllandone al contempo l'intensità per ridurre ulteriormente il fotoblesamento e prolungare il tempo di acquisizione delle immagini. L'A OTF interrompe rapidamente il laser dopo ogni esposizione di 15-30 millisecondi, quando la fotocamera non sta acquisendo immagini, evitando esposizioni non necessarie durante il trasferimento delle immagini dalla fotocamera E-M-C-C-D al computer.La luce laser viene incorporata nel sistema a disco rotante mediante uno specchio dicotroico a quattro bande (405, 488, 568, 647). L'emissione fluorescente viene separata per lunghezza d'onda utilizzando uno specchio dicotroico lungopasso a 560 nanometri abbinato a un divisore d'immagine. Il canale verde viene filtrato mediante un filtro passa-banda a 525/50 nanometri, mentre il canale rosso viene filtrato mediante un filtro passa-banda a 609/54 nanometri. I due canali vengono proiettati affiancati sulla camera E-M-C-C-D.Mentre la camera di imaging si sta riscaldando, preparare le cellule per l'esperimento di trasferimento da cellula a cellula. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule ette che esprimono HIV gag IGFP. Posizionare l'emocitometro in una piastra di Petri per evitare l'esposizione diretta alle cellule che esprimono il virus.Lavare le cellule con un mezzo indipendente dal biossido di carbonio e risospendere nel mezzo per l'analisi in tempo reale delle cellule vive a una concentrazione da uno a tre per 10 alla settima cellule per millilitro. L'uso di un mezzo indipendente dal biossido di carbonio elimina la necessità di una camera ambientale con biossido di carbonio. Per l'analisi mediante microscopia.Le cellule vengono anche contate, lavate e risospese le cellule T primarie marcate CD4 positive come appena mostrato per le cellule dur hat. Successivamente, avviare il trasferimento cellula-cellula mescolando 20 microlitri di cellule dur hat transfezionate con HIV gag IGFP con 40 microlitri di cellule T primarie marcate CD4 positive e caricare 50 microlitri in una camera microscopica EBD trattata per colture cellulari e permeabile ai gas. Sigillare la camera con tappi e fissare i tappi avvolgendo l'interfaccia tra tappo e camera EBD con parafilm.Pulire la camera di imaging con un panno chimico imbevuto di etanolo al 70% e lasciarla asciugare brevemente all'aria nella cappa. Trasportare la camera di imaging sigillata all'interno di un contenitore chiuso per evitare esposizioni accidentali. Se la camera dovesse cadere durante il trasporto subito dopo aver caricato la camera di imaging IBD con le cellule, montare il dispositivo sul microscopio.Acquisire immagini di coppie di cellule utilizzando un obiettivo ad immersione in olio 60x 1,42 NA poiché l'elevata apertura numerica migliora notevolmente la risoluzione, massimizzando la velocità di acquisizione per pile di immagini 3D. Ridurre l'area di registrazione della telecamera EM CD all'area immediatamente circostante una coppia di cellule. Inoltre, un grande passo in Z compreso tra 0,45 e 0,75 micrometri può contribuire ad accelerare l'acquisizione in queste condizioni.Le immagini vengono registrate continuamente a intervalli di 20-60 minuti. L'acquisizione ripetuta di immagini dello stesso punto del campione può protrarsi fino a sei ore con un minimo sbiancamento fotoindotto. Ogni segmento di dati è composto da decine di migliaia di immagini che possono occupare un totale di cinque-20 gigabyte.Per facilitare il trasporto e l'analisi dei file di grandi dimensioni, ogni file viene suddiviso ed esportato come segmenti di file immagine TIFF da un gigabyte. Per analizzare le immagini acquisite, utilizzare uno dei diversi programmi software per l'analisi delle immagini. Consultare il protocollo scritto allegato per i dettagli sull'analisi delle immagini, inclusa la correzione della perdita di intensità e il tracciamento automatico e manuale dei punti gag.Entro 10-15 minuti dal mescolamento, è possibile visualizzare cellule di gatto che esprimono HIV gag IGFP aderire a cellule T primarie CD4 positive nell'immagine. Questi coniugati permettono di valutare i movimenti dei punti di gag nelle cellule infette così come nelle cellule bersaglio. Dopo la sinapsi, entro 30 minuti fino a tre ore, si può osservare il movimento dei punti di gag IGFP nelle cellule bersaglio marcate con cell tracker.Abbiamo appena mostrato come visualizzare il trasferimento da cellula a cellula dell'HIV tra linfociti T. Quando si eseguono queste procedure, è molto importante ricordare di osservare tutte le precauzioni di livello di sicurezza biologica due più o di livello di sicurezza biologica tre quando si manipolano campioni esposti a cellule esprimenti HIV. Ricordare inoltre di utilizzare cellule JCA ben mantenute e DNA privo di endotossine per ottimizzare la trasfezione.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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