Visualizzazione Cell-per-cell trasferimento del virus HIV usando cloni fluorescenti di HIV e Live Microscopia confocale

Questa procedura utilizza l'immagine di cellule vive per visualizzare il trasferimento di HIV marcato con GFP attraverso le sinapsi virologiche tra cellule T jerk CAT che esprimono HIV e cellule T primarie non infette. Il saggio di trasferimento da cellula a cellula inizia con la trasfezione delle cellule T jerk CAT con HIV gag IG FP, un clone fluorescente infettivo di HIV-1; le cellule jerk CAT transfezionate che esprimono HIV gag IG FP vengono quindi mescolate con cellule T primarie non infette marcate con C-M-T-M-R e caricate in una camera di imaging, dove può essere osservato il trasferimento di HIV marcato con GFP attraverso la sinapsi virologica.

I dati ottenuti vengono analizzati mediante software di analisi delle immagini per rivelare i dettagli del trasferimento dell'HIV attraverso le sinapsi virologiche delle cellule T. Ciao, mi chiamo Benjamin Dale del laboratorio di Ben Chen del Dipartimento di Medicina della Mount Sinai School of Medicine. Il mio nome è Greg McNerney, del laboratorio del Dott. Thomas Huser presso il Centro NSF per la Biopotonica del centro medico dell'uc Davis.

E io sono Deanna Thompson, anch'io del laboratorio del Dott. Thomas Huser. Oggi vi mostreremo un procedimento per visualizzare il trasferimento cellulare di HIV-1 mediante microscopia confocale in tempo reale. In questo procedimento, le cellule Jurkat vengono trasfettate con un clone molecolare infettivo di HIV, esclusivamente da personale di laboratorio addestrato che opera in condizioni di biosicurezza certificate.

Le camere per colture cellulari di livello due più o di livello di biosicurezza tre possono eseguire il protocollo qui mostrato. Il lavoro con HIV infettivo nelle strutture di imaging deve essere approvato dall'ufficio locale per la biosicurezza dell'istituto. Mantenere le cellule jerk cat da utilizzare come cellule donatrici a una concentrazione compresa tra due volte 10 alla quinta e otto volte 10 alla quinta cellule per millilitro.

Nella coltura di cellule di gatto jerk, una concentrazione cellulare superiore a otto volte 10 alla quinta cellule per millilitro provoca una riduzione dell'efficienza di trasduzione. Per iniziare la procedura, trasfettare cinque volte 10 alla sesta cellule di gatto jerk con il plasmide virale HIV gag IGFP utilizzando il metodo di nucleofezione amax come descritto nel protocollo scritto allegato, quindi lasciare riposare le cellule durante la notte. I linfociti mononucleati del sangue periferico vengono purificati da strati buffy di sangue umano intero mediante centrifugazione su gradiente di densità FICO.

I linfociti T CD4 positivi primari vengono purificati dai globuli bianchi mononucleati del sangue periferico mediante selezione negativa utilizzando un kit di isolamento per linfociti T CD4 positivi. I linfociti T CD4 positivi ottenuti per selezione negativa vengono raccolti da una colonna magnetica e coltivati nel nostro mezzo PMI contenente il 10% di FPS, integrato con 10 unità per millilitro di IL-2 ricombinante umana. È inoltre possibile suddividere in aliquote i linfociti T CD4 positivi isolati e congelarli avvalendosi di contenitori criogenici. I contenitori vengono collocati in un congelatore a meno 70 gradi Celsius per un periodo minimo di tre-quattro ore.

Le cellule vengono quindi trasferite nell'azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Ora che le cellule jerk head sono state trasfettate e le cellule T primarie bersaglio CD4 positive sono state isolate, procedere alla purificazione e all'etichettatura delle cellule nel giorno successivo alla trasfezione. Le cellule jerk esprimono ora il costrutto infettivo di HIV fluorescente.

Quando si manipolano campioni infettivi, indossiamo un camice da laboratorio con chiusura anteriore e due paia di guanti. Rimuovere i detriti cellulari dalle cellule transfezionate mediante centrifugazione su un mezzo con alta densità di pacchetti fial. Prima distribuire 1,5 millilitri di fial pack sul fondo di un tubo conico da 15 millilitri.

Quindi, sovrapporre delicatamente il materiale a gradiente con le cellule transfettate jerk hat in un volume di cinque millilitri del nostro mezzo PMI. A questo punto, le cellule transfettate jerk hat sono in grado di produrre HIV infettivo. Pertanto, tutte le punte di pipetta che vengono a contatto con le cellule esprimenti HIV devono essere disinfettate con una soluzione di ipoclorito al 10%.

Prima di smaltire in un contenitore all'interno della cappa a sicurezza biologica, chiudere il tubo con il tappo e spruzzare l'esterno del tubo con una soluzione di etanolo al 70%, quindi asciugare con un fazzoletto di carta kim. Centrifugare le cellule a 400 G per 20 minuti a temperatura ambiente con la frenata disattivata. Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta per rimuovere con attenzione le cellule dall'interfaccia con il mezzo e trasferire le cellule in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Diluire le cellule con il nostro mezzo PMI fino a un volume totale di 15 millilitri e centrifugare a 300 G per 10 minuti.

A temperatura ambiente, sospendiamo il pellet in tre millilitri di mezzo di coltura jerk hat e trasferiamo in una pozzetta da due centimetri di una piastra a sei pozzette. Posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari fino al momento dell'utilizzo, previsto per il giorno successivo. Nella serata dello stesso giorno, etichettare le cellule T primarie CD4 positive utilizzate come cellule bersaglio al fine di distinguerle dalle cellule del donatore. Pellettare per quattro volte 10 delle sei cellule T primarie CD4 positive centrifugando a 400 ×g per 10 minuti.

Quindi lavare le cellule con cinque millilitri di PBS e risospendere in due millilitri di PBS, aggiungere il colorante orange per il tracciamento cellulare a una concentrazione finale di 1,5 micromolare e incubare a 37 gradi Celsius per minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere otto millilitri di mezzo completo CHICA e centrifugare a 400 G per 10 minuti.

Risospendere le cellule in tre millilitri di terreno completo integrato con 10 unità per millilitro di IL-2 e collocare nell'incubatore per colture cellulari per tutta la notte. Al termine dell'incubazione notturna, le cellule donatrici e le cellule bersaglio sono pronte per l'esperimento di trasferimento da cellula a cellula. Prima di avviare l'esperimento di trasferimento da cellula a cellula, preparare la camera per imaging per attenuare le fluttuazioni di temperatura nell'ambiente.

Per escludere la luce ambientale di fondo, un ampio telo nero viene disposto sopra l'intero sistema di riscaldamento del microscopio, creando una tasca d'aria isolante intorno al sistema. La camera di imaging è mantenuta a una temperatura stabile di 37 gradi Celsius mediante un riscaldatore termostatico dotato di una punta a termocoppia di tipo T posizionata accanto al campione per il controllo della temperatura. Riscaldare in anticipo per 30 minuti prima di montare il campione.

L'imaging confocale a disco rotante con un microscopio ottico invertito viene utilizzato per creare immagini confocali tridimensionali del trasferimento di HIV da cellula a cellula. Tutti i componenti hardware e l'acquisizione, inclusa una piattaforma Z, sono controllati dal software Andor IQ versione 1.8. La scansione viene eseguita da un'unità confocale a disco rotante CSU10 che utilizza contemporaneamente più di 800 punti confocali, aumentando notevolmente la velocità di scansione per sfruttarne al meglio la rapidità. Il CSU10 è abbinato a una camera altamente sensibile a moltiplicazione elettronica CCD, che consente l'imaging rapido in condizioni di scarsa illuminazione, riducendo così sia il fotobiancamento sia la fototossicità.

La sorgente luminosa a fluorescenza è un laser a gas ad ioni di argon e krypton multilunghezza d'onda. Un filtro ottico accordabile And or Oko o A OTF viene utilizzato per selezionare le lunghezze d'onda desiderate, che in questo caso sono 488 nanometri e 568 nanometri, controllandone al contempo l'intensità al fine di ridurre ulteriormente il fotobiancamento e prolungare il tempo di acquisizione delle immagini. L'A OTF interrompe rapidamente il laser dopo ogni esposizione di 15-30 millisecondi, quando la fotocamera non sta acquisendo immagini, evitando esposizioni non necessarie durante il trasferimento delle immagini dalla fotocamera E-M-C-C-D al computer.

La luce laser viene incorporata nel sistema a disco rotante utilizzando uno specchio dicromatico quadruplo a bande 405, 488, 568, 647. L'emissione fluorescente viene separata per lunghezza d'onda mediante uno specchio dicromatico lungopasso a 560 nanometri abbinato a un divisore di immagine. Il canale verde viene filtrato utilizzando un filtro passa-banda a 525/50 nanometri, mentre il canale rosso viene filtrato con un filtro passa-banda a 609/54 nanometri. I due canali vengono proiettati affiancati sulla camera E-M-C-C-D.

Mentre la camera di imaging si sta riscaldando, preparare le cellule per l'esperimento di trasferimento da cellula a cellula. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule ette che esprimono HIV gag IGFP. Posizionare l'emocitometro in una piastra di Petri per evitare l'esposizione diretta alle cellule che esprimono il virus.

Lavare le cellule con un mezzo indipendente dal biossido di carbonio e risospendere in un mezzo per l'immagine delle cellule vive a una concentrazione da uno a tre per 10 alla settima cellule per millilitro. L'uso di un mezzo indipendente dal biossido di carbonio elimina la necessità di una camera ambientale con biossido di carbonio. Per l'acquisizione delle immagini.

Le cellule vengono inoltre contate, lavate e risospese le cellule T primarie marcate CD4 positive come appena mostrato per le cellule dur hat. Successivamente, avviare il trasferimento cellula a cellula mescolando 20 microlitri di cellule dur hat trasfettate con HIV gag IGFP con 40 microlitri di cellule T primarie marcate CD4 positive e caricare 50 microlitri in una camera microscopica EBD trattata per colture cellulari e permeabile ai gas. Sigillare la camera con tappi e fissare i tappi avvolgendo l'interfaccia tra tappo e camera EBD con parafilm.

Pulire la camera di imaging con un panno chimico imbevuto di etanolo al 70% e lasciarla asciugare brevemente all'aria nella cappa. Trasportare la camera di imaging sigillata all'interno di un contenitore chiuso per evitare esposizioni accidentali. Se la camera dovesse cadere durante il trasporto subito dopo aver caricato la camera di imaging IBD con le cellule, montare il dispositivo sul microscopio.

Acquisire immagini di coppie di cellule utilizzando un obiettivo ad immersione in olio 60x 1,42 NA poiché l'elevata apertura numerica migliora notevolmente la risoluzione, massimizzando al contempo la velocità di acquisizione per pile di immagini 3D. Ridurre l'area di registrazione della telecamera EM CD alla zona immediatamente circostante la coppia di cellule. Inoltre, un grande passo in Z compreso tra 0,45 e 0,75 micrometri può contribuire ad accelerare l'acquisizione in queste condizioni.

Le immagini vengono registrate continuamente a intervalli di 20-60 minuti. L'acquisizione ripetuta di immagini dello stesso punto del campione può protrarsi fino a sei ore con un minimo sbiancamento fotoindotto. Ogni segmento di dati è composto da decine di migliaia di immagini che possono occupare un totale di 5-20 gigabyte.

Per facilitare il trasporto e l'analisi dei file di grandi dimensioni, ogni file viene suddiviso ed esportato come segmenti di file immagine TIFF da un gigabyte. Per analizzare le immagini acquisite, utilizzare uno qualsiasi dei diversi programmi software per l'analisi delle immagini. Consultare il protocollo scritto allegato per i dettagli sull'analisi delle immagini, inclusa la correzione della perdita di intensità e il tracciamento automatico e manuale dei punti di gag.

Entro 10-15 minuti dal mescolamento, è possibile visualizzare cellule di gatto che esprimono HIV gag IGFP aderire a cellule T primarie CD4 positive nell'immagine. Questi coniugati permettono di analizzare i movimenti dei punti di gag nelle cellule infette così come nelle cellule bersaglio. Dopo la sinapsi, entro 30 minuti fino a tre ore, si può osservare il movimento dei punti di gag IGFP all'interno delle cellule bersaglio marcate con cell tracker.

Abbiamo appena mostrato come visualizzare il trasferimento da cellula a cellula dell'HIV tra linfociti T. Quando si eseguono queste procedure, è molto importante ricordare di osservare tutte le precauzioni di livello di sicurezza biologica due più o di livello di sicurezza biologica tre quando si manipolano campioni esposti a cellule esprimenti HIV. Ricordare inoltre di utilizzare cellule JCA ben mantenute e DNA privo di endotossine per ottimizzare la trasfezione.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.