Name: Lo xenotrapianto di cellule staminali umane in embrioni di pollo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 42 s
Description: Impara il metodo di xenotrapianto di cellule staminali umane nel sistema nervoso centrale di embrioni di pollo. Questa tecnica consente di studiare in vivo il comportamento, la proliferazione e la differenziazione cellulare.

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Il lavoro è stato supportato anche da finanziamenti Helse og rehabilitering (JLB), il norvegese Research Council (GH e JCG) e l&#39;Università di Oslo (NK e JCG).

1. Isolamento e la coltura di cellule staminali umane e la preparazione per l'iniezione in embrioni <ol><li> Le cellule staminali umane utilizzate come esempi di questo protocollo (cervello, adiposo, midollo osseo) sono isolati in modo diverso dai diversi tessuti. Per esempio, cellule staminali neurali adulte vengono isolate dai pezzi di tessuto raccolti dalla parete del ventricolo del cervello durante la neurochirurgia endoscopica, che sono poi dissociate alle singole celle che vengono coltivate in vitro. Le cellule staminali neurali formano spontaneamente neurosfere che galleggiano nel mezzo di coltura, mentre altri tipi di cellule aderire al fondo del piatto 7. Derivate da tessuto adiposo cellule staminali mesenchimali sono ottenuti da materiale liposuzione che è enzimaticamente digerito e tese a rimuovere il tessuto fibroso e poi centrifugato per rimuovere adipociti maturi. Le cellule risultanti sono risospese in terreno di coltura integrato con siero di promuovere la proliferazione delle cellule staminali in altri tipi di cellule staminali emopoietiche e 8 cellule progenitrici possono essere isolati da aspirati di midollo osseo da una selezione positiva utilizzando anticorpi specifici coniugati con particelle magnetiche (Myltenyi Biotec, Germania o Dynal-Invitrogen, USA) e la separazione delle cellule magnetiche e / o utilizzando anticorpi coniugati con fluorofori e fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS) 9. </li><li> Per facilitare la successiva identificazione, etichetta le cellule staminali con un marcatore fluorescente prima dell'impianto in embrioni di pollo. Le cellule staminali possono essere etichettati con coloranti fluorescenti lipofili come DII (Invitrogen, USA) o PKH26 (Sigma, USA) utilizzando protocolli di fornitore-raccomandato fino a poco prima dell'impianto, o, per una etichetta permanente essenzialmente alcun pericolo di cellule ospiti contaminanti, possono essere trasdotte con il gene di una proteina fluorescente come proteina fluorescente verde, utilizzando vettori lentivirali, pur nella cultura 10. </li><li> Protocolli per la cultura e la propagazione delle cellule staminali umane possono variare. Protocolli dettagliate sono disponibili in letteratura. Brevemente, una sfera che formano le cellule staminali sono tipicamente coltivate in fiasche, mentre le cellule staminali aderenti sono tipicamente coltivate in piastre di Petri (che facilitano la triturazione quando spacca, vedi sotto), in mezzo adeguato. Per la suddivisione o la raccolta, pellet sfera che formano le cellule del 5 centrifugazione min a 1200rpm e risospendere in pre-riscaldato tripsina / EDTA soluzione per non più di 5 minuti a 37 gradi Celsius. Per le cellule aderenti aggiungere la tripsina / EDTA soluzione alla capsula di Petri, e triturare alla fine di 5 minuti. Terminare il tripsinizzazione con l'aggiunta di Ca 2 + mezzo contenente, a volte completati con l'albumina. Per rimuovere la tripsina / EDTA, centrifugare le cellule (5 min a 1200rpm), rimuovere il surnatante, risospendere in veicolo di iniezione a freddo (in genere medio o PBS), e centrifugare di nuovo (5 min a 1200rpm). Rimuovere la maggior parte di questo supernatante e risospendere delicatamente le cellule per creare una sospensione di cellule altamente concentrato. </li><li> Mantenere la sospensione di cellule staminali umane in una piccola fiala innevate o provetta da microcentrifuga in ghiaccio per diverse ore prima dell'iniezione. Sopravvivenza in questo stato può essere di tipo cellulare-dipendente. Il veicolo iniezione deve essere ottimizzato in base alle proprietà delle cellule, comprese le loro adesività (ad esempio un basso Ca 2 + veicolo può aiutare a prevenire grumi) e resistenza alle variazioni di ipossia e pH. </li></ol> 2. Uovo di incubazione e di preparazione <ol><li> Conservare le uova fecondate in una camera di raffreddamento (per esempio: Termaks, Bergen, Norvegia) a 14-15 ° C prima dell'incubazione. A questo sviluppo temperatura è arrestato fino a quando inizia l'incubazione. Uova fecondate conservati per più di 10 giorni a temperature più basse hanno un tasso più basso di successivo sviluppo e la sopravvivenza. </li><li> Rilanciare lo sviluppo, posto le uova in una umidificata, tiraggio forzato incubatore (ad esempio: Binder, New York, USA) a 38-39 ° C, e incubare fino alla fase di sviluppo desiderato è raggiunto (per la stadiazione, vedi rif 11. ). </li><li> Prima di aprire l'uovo, creare una sacca d'aria sopra l'embrione con l'inserimento di un 18 ago della siringa calibro attraverso il guscio dell'uovo (non troppo in profondità per evitare di forare il tuorlo) e l'evacuazione 4 ml di albumina (Fig. A). Questo crea una caduta di pressione che in pochi minuti è pareggiato con l'entrata di aria attraverso il guscio poroso. Come l'aria entra raccoglie nel punto più alto all'interno del guscio, separando così l'embrione dalla superficie interna del guscio. </li><li> Sigillare il foro creato dal l'ago della siringa con nastro di plastica convenzionale. </li></ol> 3. Tirare micropipette di vetro <ol><li> Tirare micropipette di vetro con vetro al borosilicato (per esempio, 1,2 OD x 0,94 mm ID, Harvard Apparatus, USA) su un elettrodo estrattore convenzionale (per esempio, modello P-2000, Sutter Instruments, USA). Regolare le impostazioni estrattore di ottenere micropipette che hanno elevata resistenza d'ingresso quando viene utilizzato come Microelectrodes. Suggerimenti dovrebbe essere di circa 1-1,5 cm di lunghezza. Gli alberi possono essere contrassegnati ad intervalli di 1 mm per il calcolo dei volumi espulso. </li><li> Rompere le punte micropipetta a una dimensione praticabile piegando con una pinza o spingere contro una superficie solida durante la visualizzazione al microscopio. La rottura deve essere il più uniforme possibile in tutto il perimetro del vetro e il diametro interno conseguente alla punta dovrebbe adattarsi alle dimensioni delle cellule per essere utilizzato senza essere ostruiti. Tipicamente di 20-30 micron di diametro interno funziona bene. </li></ol> 4. Preparazione di Fast soluzione colorante verde (reagente di contrasto) <ol><li> Preparare una soluzione allo 0,1% (w / v) di Fast colorante verde (Sigma-Aldrich, USA), sciogliendo in soluzione salina fisiologica di pollo (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na- fosfato, 5 HEPES mM, 11 mM glucosio, pH 7,4). </li><li> Filtrare la soluzione rapida verde attraverso un micron 0,22 Millex GP filtro (Co. Millipore, Bedford, USA). </li></ol> 5. Aprendo le uova e contrastanti l'embrione <ol><li> Inserire due pezzi di nastro sulla parte superiore dell'uovo, che copre le dimensioni della sacca d'aria. Mantenere l'uovo orientato in modo che l'area registrato (e quindi la camera d'aria) è più alto, tagliare una piccola finestra all'interno dei confini dell'area registrato utilizzando un paio di forbici dissezione robusto. Il nastro aggiunge il supporto e aiuta a prevenire i frammenti cadano sul guscio l'embrione. Le bolle d'aria associata alla sacca d'aria possono essere estratti con il back-end di un puntale di plastica o altri sonda smussato. </li><li> Disegnare una soluzione rapida verde in una siringa da 1 ml con un ago da 25 gauge. Rimuovere eventuali bolle d'aria nella siringa e l'ago. Piegare l'ago in un angolo di 45 gradi, penetrare in un punto al di fuori della piastra embrionale (identificata con l'anello dei vasi sanguigni che lo circoscrivono, penetranti all'interno della mortalità embrionale aumenta la piastra) e con attenzione guidare il ricamo sotto l'embrione. Iniettare il colorante fino a contrasto desiderata. L'embrione, che normalmente è trasparente, dovrebbe stare fuori come un fantasma biancastro contro il colore verde scuro (Fig. B). Molti ricercatori utilizzano inchiostro di china (diluito al 10% v / v) al posto di Green veloce. In questo caso è importante utilizzare inchiostro di china che non è tossico, come inchiostro Pelikan Fonte India. </li></ol> 6. Fare romboencefalo e del midollo spinale, le lesioni del tubo neurale <ol><li> Produrre aghi affilati tungsteno di fiamma incisione breve (2-3 cm), pezzi di 100 micron di diametro asta di tungsteno (numero di catalogo 719000, A &amp; R Sistemi, Seattle, Washington), con un acetilene / ossigeno torcia. Questo viene fatto inserendo la fine dell'asta molto brevemente in la fiamma fino a quando una scintilla si vede, che rappresenta l'erosione esplosivo degli strati esterni di tungsteno, lasciandosi dietro una punta acuminata. </li><li> Utilizzando un affilato ago di tungsteno, fendere e deviare la membrana vitellina che copre la zona per microchirurgia. </li><li> Utilizzando un secondo ago di tungsteno appuntito (la punta dell'ago prima è spesso danneggiato dopo il taglio attraverso la membrana vitellina e non adatto per microchirurgia successive), tagliare con cura attraverso l'epitelio sovrastante il tubo neurale e deviare, poi tagliato intorno e sotto il pezzo del tubo neurale da rimuovere, con tratti brevi e rapidi verso l'alto (Figura C). Fare i tagli trasversali e poi i tagli longitudinali è di solito di maggior successo. Non tagliare troppo in profondità o si rischia di penetrare i vasi sanguigni sottostanti, che in genere è fatale. </li><li> Capovolgere dolcemente o trascinare il pezzo di tessuto asportato dal sito della lesione utilizzando l'ago di tungsteno. Se questo si rivela difficile, ma può anche essere rimosso mediante aspirazione bocca utilizzando una micropipetta di vetro attaccato al tubo flessibile. </li></ol> 7. Iniezione di cellule staminali umane a. L'iniezione in una lesione del tubo neurale Disegnare una piccola quantità di cellule nella punta di una micropipetta di vetro dalla bocca di aspirazione con un tubo di plastica. La concentrazione di lavoro della sospensione cellulare deve essere ottimizzato per il tipo di cellule da iniettare. Montare la micropipetta su un micromanipolatore e collegarlo ad una pompa microinjector (ad esempio: PV830 PicoPump pneumatico, WPI, Washington, USA). Sotto controllo visivo utilizzando un microscopio dissezione, guida la punta micropipetta nella lesione ed espellere attentamente le cellule, aumentando la pressione dell'aria (sia da impulsi di pressione costante o per dilagare gradualmente la pressione) (Figura C). Quando la quantità desiderata di cellule si deposita all'interno del sito della lesione, con attenzione ritirare la micropipetta. b. Iniezione nel lume del tubo neurale In alcuni casi può essere desiderabile per iniettare le cellule nei ventricoli sviluppo cerebrale, per esempio se le cellule sono invasivi sufficienti per accedere al tessuto nervoso, in assenza di lesioni. L'iniezione di cellule nel lume di brain regione richiede l'utilizzo di una fase di sviluppo in cui il lume fornisce un recipiente abbastanza grande, ed è facilmente raggiungibile; fasi HH 12-18 sono favorevoli a questo proposito. Una lesione non è necessario. Basta forare la parete del tubo neurale con la micropipetta di vetro prima dell'iniezione di cellule. Gli elementi chiave per il successo di questo metodo sono la nitidezza della micropipetta e la repentinità della penetrazione, troppo lento il movimento e la punta micropipetta può fossetta la parete del tubo neurale senza penetrare. c. Iniezione sistemica Iniezioni sistemica può essere effettuato tramite l'extra-embrionali vasi sanguigni (a partire dalla fase HH 15, quando i pescherecci ben sviluppate). Questo non è raramente accompagnata da alcuni sanguinamento e poiché ci sono molte piccole arterie e vene meno grandi, iniezioni intra-arteriosa sono generalmente più sicuri quando si tratta di sopravvivenza dell'embrione. D'altra parte, le iniezioni endovenose di fornire un accesso più rapido delle cellule al cuore e quindi probabilmente una distribuzione più uniforme delle celle. Una iniezione di successo richiede una micropipetta tagliente con un diametro più piccolo del vaso bersaglio. Approccio della nave lungo il suo asse in un piccolo angolo rispetto al piano orizzontale (circa 30 gradi). Spingere la micropipetta nei confronti della nave fino a quando la nave inizia ad occludere. Quindi spingere ulteriormente in un movimento deciso, brusco da penetrare. Ritrarre lentamente fino a quando il sangue è visto di disegnare per azione capillare nella punta della micropipetta. L'iniezione di cellule dovrebbero poi essere eseguiti usando una pressione costante, dopo di che la micropipetta è ritratta con un movimento rapido. 8. Tenuta l'uovo <ol><li> Dopo l'iniezione, lasciate l'uovo stare fermo per alcuni minuti per consentire le cellule iniettate di stabilirsi e di aderire. Per evitare la disidratazione (che può verificarsi rapidamente e può risultare fatale), giaceva un pezzo di tessuto inumidito o carta da filtro sopra la finestra durante questo periodo di riposo. </li><li> Dopo pochi minuti e le cellule si sono stabiliti, a secco il guscio attorno alla finestra e sigillare la finestra con nastro di plastica convenzionale. Assicurarsi che questo sigillo è stretto e che non albumina può fuoriuscire attraverso l'apertura o tra il serbatoio e il nastro (questo si rivela spesso fatale durante l'incubazione successive). </li><li> Sostituire le uova per la ventilazione forzata incubatore per un ulteriore sviluppo. L'osservazione può essere fatta ad intervalli rimuovendo il nastro sopra la finestra. </li></ol> 9. Embrione dissezione <ol><li> Una volta che l'embrione ha raggiunto la fase desiderata, crack aprire l'uovo in una ciotola di ghiaccio freddo soluzione fisiologica o PBS (il nastro che copre la finestra deve essere tagliato prima a permettere le due metà del guscio d'uovo per separare). Il ghiaccio-freddo salina serve per anestetizzare il bimbo con l'ipotermia. Il cuore deve rapidamente rallentare e fermarsi in un paio di minuti. </li><li> Separare l'embrione dalle membrane extraembrionali e lo stadio lo si utilizza rif. 11. </li><li> Decapitare l'embrione, il trasferimento ad un piatto dissezione che ha un pavimento in gomma di silicone e soluzione fisiologica ossigenata contiene integrato con glucosio (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na-fosfato, 5 HEPES mM, 11 mM glucosio, pH 7,4) e il pin è veloce lato ventrale in su. Rimuovere i visceri addominali e toracici. Utilizzando un forbici angolato, fare incisioni longitudinali lungo ogni aspetto ventrolaterale della colonna vertebrale. Soprattutto nelle fasi successive (dopo giorno 6 di sviluppo), l'incisione iniziale è meglio del made in regione lombo-sacrale in cui lo spazio tra le vertebre e il midollo spinale è maggiore. Rimuovere l'aspetto ventrale della colonna vertebrale per rivelare il midollo spinale. Assicurarsi che la soluzione fisiologica rimane ossigenata dalle bolle a circa 10 minuti con intervalli di puro ossigeno medicale. </li><li> Accuratamente tagliato le radici dorsali e ventrali nascente su entrambi i lati, transetto il midollo spinale a livello desiderato, e delicatamente sollevarlo fuori dal canale vertebrale. Il midollo spinale sopravviverà per molte ore in questo stato e può essere sottoposto a 12 anatomiche e fisiologiche 13,14 esperimenti. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2071/2071fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. A) L'approccio giusto per l'evacuazione di albumina. Notare la posizione dell'embrione e il posizionamento dell'ago. B) In contrasto dell'embrione. Notare il punto di penetrazione dell'ago al di fuori del disco embrionale. C) Rappresentazione schematica della procedura di lesione spinale unilaterale del tubo neurale seguita da trapianto di cellule.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;embrione di pollo è un modello animale comodo e versatile per gli esperimenti di xenotrapianto. La mancanza di un funzionale sistema immunitario durante lo sviluppo embrionale e fetale permette la sopravvivenza e lo sviluppo delle cellule di qualsiasi specie che tollera la temperatura di incubazione. Embrioni di pollo sono stati utilizzati per testare il potenziale rigenerativo di vari tipi di cellule staminali (recensione in rif. 15). Le cellule staminali dei mammiferi in grado di integrare nei tessuti embrionali di pollo compreso il sistema nervoso centrale, dove possono dare origine ai neuroni la cui assonale proiezioni, connettività sinaptica e le proprietà elettrofisiologiche possono essere valutate nel contesto funzionale di 1,2 circuiti neurali. Perché le procedure chirurgiche sono relativamente facili, e le iniezioni sono fatte sotto visive al posto di controllo stereotassico, il numero di embrioni può essere facilmente aumentata a ospitare diverse condizioni sperimentali all&#39;interno di un singolo esperimento. Tipicamente le cellule possono essere iniettato in 20-30 embrioni nell&#39;ambito di un esperimento di 4 ore. Il post-iniezione di mortalità degli embrioni è il principale fattore limitante. Devono essere prese precauzioni per evitare emorragie e disidratazione. Siate consapevoli che ci sono alcune fasi critiche di sviluppo in cui il tasso di mortalità naturale aumenta. Completa l&#39;embrione con pochi ml di caldo, l&#39;iniezione di pollo sterilizzato suoneria seguito e il giorno prima critica fasi di sviluppo, oltre ad assicurare che la finestra nell&#39;uovo è ben chiusi e ben orientata a evitare perdite, migliora la sopravvivenza. Se la perdita attraverso il nastro di sigillo dovesse accadere, rimuovere il nastro, asciugare le superfici e ri-nastro. Alcuni ricercatori uso cera e vetro o plastica coprioggetto per sigillare la finestra. La mortalità non dovrebbe essere sostanzialmente diversi in iniettato contro sham-operati embrioni. Anche se ci siamo concentrati qui l&#39;iniezione di cellule staminali umane nel anlage del cervello e del midollo spinale, le cellule staminali possono essere iniettate nel anlage di altri organi (vedi per esempio rif. 4). Ogni organo pone le proprie sfide. Per esempio, l&#39;iniezione nel cuore può essere difficile a causa della elevata resistenza meccanica alla penetrazione e pipetta a causa di movimenti, che invece può essere rallentata da un raffreddamento degli embrioni a temperatura ambiente prima dell&#39;iniezione. Organi che mancano di un lume non può accogliere l&#39;iniezione di volumi sufficienti e possono quindi richiedere lesione chirurgica per creare un recipiente. Nella nostra esperienza, post-lesione rigenerazione dei tessuti è un vantaggio perché promuove l&#39;integrazione delle cellule staminali umane nel tessuto. Le cellule possono anche essere iniettato nel mesenchima embrionale come il mesenchima disperdere somitic o la cresta neurale migrazione come un modo per raggiungere l&#39;incorporazione in derivati ​​mesenchimali, tra cui cresta neurale derivata gangli periferici 16,17.

<table><tbody><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Microscopio</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo Investigator</td><td>Programma</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topi MIP-GFP</td><td>Topi</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mathematica</td><td>Programma</td><td>Wolfram</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>Programma</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>Programma</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lo xenotrapianto di cellule staminali umane in embrioni di pollo

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

L&#39;embrione di pollo è un classico modello animale per studiare il normale sviluppo embrionale e fetale e per gli esperimenti di xenotrapianto di studiare il comportamento delle cellule in una forma standardizzata<em&gt; In vivo</em&gt; Ambiente. I principali vantaggi di un embrione di pollo sono a basso costo, l&#39;accessibilità, facilità di manipolazione chirurgica e la mancanza di un sistema immunitario completamente sviluppato. Lo xenotrapianto in embrioni di pollo in grado di fornire informazioni preziose sulla proliferazione cellulare, la differenziazione e il comportamento, le risposte delle cellule di segnali in definizione nicchie tessuti embrionali, e il potenziale oncogeno. Trapianto di cellule in embrioni di pollo può essere anche un passo verso esperimenti di trapianto in altri modelli animali. Recentemente l&#39;embrione di pollo è stato utilizzato per valutare il potenziale di neurogena staminali umane e cellule progenitrici dopo l&#39;impianto in anlage neurale<sup&gt; 1-6</sup&gt;. In questo video documentiamo l&#39;intera procedura per il trapianto di cellule staminali umane nel sviluppo del sistema nervoso centrale di un embrione di pollo. La procedura inizia con l&#39;incubazione delle uova fecondate fino embrioni di età desiderata si sono sviluppate. Il guscio viene quindi aperto, e l&#39;embrione contrastato da iniettare mezzo di contrasto tra l&#39;embrione e il tuorlo. Piccole lesioni sono realizzati in tubo neurale mediante microchirurgia, creando un luogo di rigenerazione per la deposizione delle cellule che promuove la successiva integrazione nel tessuto ospite. Dimostriamo iniezioni di cellule staminali umane in tali lesioni fatte nella parte del tubo neurale che forma il romboencefalo e il midollo spinale, e nel lume della parte del tubo neurale che forma il cervello. Iniezioni sistemiche in extraembrionali vene e le arterie sono anche dimostrato come un modo alternativo per fornire cellule ai tessuti vascolarizzati compreso il sistema nervoso centrale. Infine mostriamo come rimuovere l&#39;embrione dalle uova dopo alcuni giorni di ulteriore sviluppo e il modo di sezionare il midollo spinale libera per la successiva analisi fisiologiche, biochimiche e istologiche.

In questo articolo presentiamo un metodo per il trapianto di cellule staminali umane in varie regioni del sistema nervoso centrale di un embrione di pollo. Ciò fornisce un<em&gt; In vivo</emModello&gt; per valutare la proliferazione e la differenziazione dei vari tipi di cellule staminali umane negli ambienti di tessuti embrionali.

Lo xenotrapianto di cellule staminali umane in embrioni di pollo

L'embrione di pollo è un modello animale classico per lo studio dello sviluppo embrionale e fetale normale e per gli esperimenti di xenotrapianto volti a studiare il...

Ciao, sono Joel Glover del Centro norvegese per la ricerca sulle cellule staminali. Un aspetto importante nella ricerca sulle cellule staminali è la progettazione di sistemi in vivo per testare il potenziale differenziativo delle cellule staminali. In questo video, io e i miei colleghi mostreremo come utilizzare l'embrione di pollo come ospite in vivo per il trapianto eterologo.Nei studi sulle cellule staminali umane, si permette agli ovuli fecondati di svilupparsi in un incubatore caldo e umidificato fino a quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio desiderato. Innanzitutto, lavare le uova con etanolo al 70%. Successivamente, rimuovere circa quattro millilitri di albume utilizzando una siringa e un ago da 18 gauge per creare una bolla d'aria sopra l'embrione. Evitare di forare il tuorlo.Durante questo processo, la camera d'aria è necessaria per evitare di danneggiare l'embrione. Quando si apre la finestra nel guscio dell'uovo, il foro viene praticato con l'ago utilizzando un nastro adesivo di plastica convenzionale. Il passo successivo consiste nel tagliare una finestra attraverso il guscio dell'uovo sopra la camera d'aria per rafforzare il guscio e impedire che frammenti del guscio cadano sull'embrione.Applicare del nastro sulla bolla d'aria e quindi tagliarla utilizzando un paio di forbici da dissezione robuste, stando attenti a rimanere entro i limiti della bolla d'aria. Eventuali bolle d'aria presenti sull'embrione possono essere eliminate con una sonda ottusa, come l'estremità posteriore di un puntale per pipetta. Per contrastare l'embrione, preparare una soluzione di verde rapido allo 0,1% in soluzione salina fisiologica per pollo e filtrare attraverso un filtro millipore da 0,22 micron.Piegare un ago da 25 gauge ed aspirare la soluzione di verde rapido in una siringa da un millilitro. Per iniettare il colorante al di sotto dell'embrione senza danneggiare la placca embrionale, inserire l'ago attraverso la parete del tuorlo dell'uovo al di fuori della placca. Qui si può osservare la soluzione di verde rapido diffondersi al di sotto dell'embrione trasparente, che appare quindi come un'ombra bianca sullo sfondo scuro, permettendo l'accesso all'embrione.Prima tagliare e deviare la membrana di villina che ricopre la regione di interesse utilizzando un ago affilato al tungsteno, quindi usare un ago al tungsteno fresco e inciso a fuoco per escindere unilateralmente un frammento del tubo neurale. Utilizzare movimenti decisi verso l'alto. In genere, è preferibile eseguire uno o entrambi i tagli longitudinali prima dei tagli trasversali.Rimuovere i tessuti in eccesso con una micropipetta di vetro e aspirazione orale. Aspirare un piccolo volume delle cellule da iniettare nella punta di una micropipetta di vetro collegata a un tubo di plastica. Montare la pipetta in un supporto per micropipette, adatto per iniezioni a pressione e collegato a una micropompa azionata ad aria.Utilizzando un micromanipolatore, posizionare con cura la punta della micropipetta ed depositare le cellule nella lesione aumentando lentamente la pressione. Per creare lesioni nel cervelletto, iniziare rimuovendo la membrana villosa come mostrato in precedenza. Asportare un frammento del cervelletto nel tubo neurale in modo unilaterale mediante un ago di tungsteno affilato.Il tessuto in eccesso può essere rimosso con una micropipetta di vetro utilizzando l'aspirazione orale. Quindi iniettare le cellule nella lesione come mostrato in precedenza. Per lesioni del midollo spinale, le cellule possono anche essere iniettate direttamente nel lume del tubo neurale.Per questo, si utilizza una micropipetta riempita con una punta affilata per perforare la parete del tubo neurale, quindi le cellule vengono iniettate aumentando lentamente la pressione. Le cellule staminali possono anche essere somministrate mediante iniezione intravascolare in vasi extraembrionali, ad esempio in una vena. Come mostrato qui, le cellule vengono mescolate con un colorante verde brillante per evidenziare in modo più chiaro il loro movimento all'interno del sistema circolatorio.Osservare la rapida diffusione al cuore e, di conseguenza, alla circolazione embrionale. In questo caso, un'iniezione in un'arteria extraembrionale. In entrambi i casi, una micropipetta affilata deve essere inserita con decisione attraverso la parete del vaso e poi leggermente ritratta per alleviare la resistenza, prima di iniettare le cellule a seguito dell'iniezione.Non spostare l'uovo per diversi minuti, in modo da permettere alle cellule iniettate di depositarsi e aderire al tessuto ospite. Durante questo periodo, la finestra può essere coperta con carta da filtro inumidita, quindi sigillare accuratamente la finestra utilizzando nastro adesivo di plastica. Assicurarsi che l'albume non possa fuoriuscire tra il nastro e il guscio dell'uovo.Questo è quasi sempre fatale durante la successiva incubazione. Qui possiamo vedere l'embrione attraverso la finestra nel guscio dell'uovo diversi giorni dopo l'iniezione delle cellule. Osservare i movimenti embrionali tipici per rimuovere l'embrione dall'uovo.Per prima cosa, riempire una piccola ciotola con soluzione salina tamponata al fosfato ghiacciata. Quindi tagliare il nastro intorno alla finestra e rompere delicatamente l'uovo, lasciando fuoriuscire il contenuto nella ciotola. La bassa temperatura agisce come anestetico attraverso l'ipotermia.Tagliare le membrane extraembrionali attorno all'embrione, quindi trasferire l'embrione in una bacinella per dissezioni con fondo in silicone contenente soluzione salina fisiologica fredda. Rimuovere delicatamente le membrane extraembrionali, poi decapitare l'embrione ed estrarre il cuore. Dopo aver fissato l'embrione con la faccia dorsale rivolta verso il basso, è possibile rimuovere il resto delle viscere per esporre la superficie ventrale della colonna vertebrale.Il sangue in eccesso deve essere rimosso con una pipetta accuratamente tagliando tra le vertebre e il midollo spinale con due incisioni longitudinali parallele ed eliminando le vertebre per esporre la superficie ventrale del midollo spinale. Il midollo spinale può quindi essere dissezionato liberandolo con un'incisione attraverso le radici ventrali e dorsali in formazione su entrambi i lati. Speriamo che questo video sia stato utile e vi auguriamo buona fortuna nei vostri esperimenti.

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Utilizzando punta fine micropipette iniettiamo DNA plasmidico in sottodomini di somiti pollo o tubi neurali. La concentrazione del plasmide è regolata per generare solo cellule transfettate. Abbiamo poi permettere alle cellule di trasformarsi in popolazioni clonale.

Cella Transfection singola in embrioni di pollo

Un approccio per l'analisi della migrazione e il destino finale di aviaria cellule della cresta neurale a quaglie-chick embrioni chimera è descritta. Questo metodo è una tecnica semplice e diretto per il tracciamento cellule della cresta neurale durante la migrazione e la differenziazione che sono altrimenti difficili da distinguere all'interno di un embrione di pollo non manipolata.

Analisi della migrazione cresta neurale e la differenziazione delle specie da Cross-trapianto

Mieloma multiplo (MM), le cellule umane richiedono il microambiente favorevole cellule mesenchimali e componenti della matrice extracellulare per la sopravvivenza e la proliferazione. Abbiamo stabilito un vivo pollo modello embrione con cellule di mieloma e mesenchimali umane trapiantate per studiare gli effetti dei farmaci anti-tumorali sulla crescita del tumore, l'invasione e l'angiogenesi.

Istituzione di un mieloma multiplo umano Xenograft modello nel pollo per studiare la crescita del tumore, invasione e l&#39;angiogenesi

Innestando perline imbevute di fattori di crescita o inibitori specifici delle vie di segnalazione negli embrioni in via di sviluppo, è possibile testare direttamente i loro effetti in vivo. In questo protocollo, le perle vengono innestate nella gemma dell'arto per determinare gli effetti di queste molecole sull'espressione genica e sulla trasduzione del segnale.

L&#39;innesto di Perline in via di sviluppo di pollo Limbs embrioni per identificare percorsi di trasduzione del segnale che influenzano l&#39;espressione genica

Questo articolo fornisce un metodo per isolare puri tessuti embrionali da embrioni di pollo e quaglie che possono essere combinati per formare ex vivo chimerico organi.

Isolamento dei tessuti embrionali e formazione degli organi chimerici quaglia-pollo, utilizzando l'esempio di timo

L'obiettivo generale di questo articolo è quello di descrivere come eseguire l'iniezione intracellulare ovo di materiali esogeni in embrioni di pollo. Questo approccio è molto utile per studiare la biologia dello sviluppo degli embrioni di pollo.

In zona Ovo Iniezione intravascolare in embrioni di pollo

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per il trapianto di organoidi renali nella cavità celomica degli embrioni di pollo. Questo metodo induce la vascolarizzazione e una maggiore maturazione degli organoidi entro 8 giorni e può essere utilizzato per studiare questi processi in modo efficiente.

Vascolarizzazione efficiente degli organoidi renali attraverso il trapianto di intracelomica negli embrioni di pollo

L'introduzione di un gene di interesse in una cellula è un metodo potente per chiarire la sua funzione in vivo. Questo protocollo descrive un metodo efficace di trasfezione di una cultura dei diritti umani neurali staminali / precursori delle cellule (hNSPCs) con l'apparecchiatura di Nucleofector elettroporazione fatta da Amaxa.

Trasfezione delle cellule staminali neuronali con il Nucleofector Amaxa

Conoscenza del numero esatto di cellule vitali è necessaria per manipolazioni molte colture di tessuti. Questo protocollo descrive come distinguere tra cellule vive e morte e quantificare le cellule utilizzando un emocitometro. Anche se descrive il conteggio umano neurali staminali / precursori delle cellule (hNSPCs), può essere utilizzato per altri tipi di cellule.

Conteggio cellule staminali neuronali

La capacità di manipolare le staminali neurali umane / precursore cellule (hNSPCs) in vitro permette di indagare la loro utilità come i trapianti di cellule a fini terapeutici e di esplorare lo sviluppo umano neurale. Questo protocollo presenta un metodo di coltura e hNSPCs passaging nella speranza di aumentare la riproducibilità della ricerca sulle cellule staminali.

Passaging cellule staminali neuronali

Impara il metodo di xenotrapianto di cellule staminali umane nel sistema nervoso centrale di embrioni di pollo. Questa tecnica consente di studiare in vivo il comportamento, la proliferazione e la differenziazione cellulare.

Lo xenotrapianto di cellule staminali umane in embrioni di pollo

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