Name: Microiniezioni endovenosa di larve Zebrafish allo Studio danno renale acuto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-04T17:32:00.000+00:00
Duration: 15 min 55 s
Description: Impara a indurre lesioni renali acute in larve di Danio rerio mediante microiniezione endovenosa di gentamicina. Questo metodo consente di visualizzare i danni tubulari con immunistochimica per studiare nefrotossicità e meccanismi di riparazione renale.

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Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health (NIH) concede R01DK069403 e P30DK079307.

Parte del protocollo che segue si basa su metodi pubblicati riportato da (Hentschel et al. 2005) e (Weinstein et al. 1995) con lievi modifiche. Parte 1: Microiniezioni Impostare in anticipo per la microiniezione <ul><li> I pesci vengono iniettati a 2 giorni dopo la fecondazione (DPF). Pertanto, zebrafish adulti sono allevati 3 notti prima di un esperimento programmato. Raccogliere embrioni e porle in una piastra di Petri con acqua E3 (5mm NaCl, KCl 0,17 mm, 0,33 mm di CaCl 2, 0,33 mm MgSO 4) a 28.5 ° C. Al termine della prima giornata rimuovere gli embrioni morti dalla piastra di Petri e gli embrioni separati in modo che non ci sono 80-100 embrioni per piastra di Petri. </li><li> Preparare gli aghi di vetro tirando da tubi capillari (4 cm di lunghezza, 0,63 / 0,20 OD / ID millimetri (mm) R-6 tubi di vetro personalizzati Drummond società scientifiche, Broomall, PA 9-000-3000) con un estrattore elettrodo. Il diametro punta dovrebbe essere di 10-20 micron. Sotto un microscopio da dissezione (Leica S6E), con un pennarello indelebile consumare circa 10 linee 1 millimetro lungo l'ago, con l'aiuto di un righello, e conservare gli aghi in un grande piatto di Petri su rampe d'argilla. </li><li> Preparare la pipetta azienda: Fire-lucidare la punta di un sottile tubo di vetro borosilicato parete capillare (152 mm, 1 / 0,75 OD / mm ID TW100-6, strumenti di precisione del Mondo, Inc.) in una fiamma becco Bunsen fino al diametro interno di la punta è 0,4-0,5 mm. Tale dimensione consente una buona presa del sacco vitellino di una larva 2 dpf zebrafish. Tenere una estremità di un pezzo di vetro capillare con pinze lunghe, e il calore con la punta opposta del capillare con il becco Bunsen, posizionandolo in verticale sopra il cono di luce azzurra interna della fiamma, la parte più calda, per 1-2 secondi, rotolare per ottenere un ancora sciogliersi. Ripetere questa operazione un paio di volte quindi esaminare il capillare al microscopio, su un micrometro (Ward 94 W 9910). Questo è un passo critico, potrebbe essere necessario fuoco lucidare un pipette tenendo pochi e selezionare il formato più tardi, mentre si stanno manipolando le larve. Se si sta attenti, un'azienda pipetta dura microiniezione sessioni multiple. </li><li> Riempire la pompa manuale Microsiringa (MMP, World Precision Instruments, Inc.,) con olio minerale, seguendo le istruzioni fornite dal produttore. Il titolare pipetta è inserito in un manipolatore joystick (Narishige, MN-151), collegato con un supporto magnetico (Narishige, MN 151) a una piastra di ferro (Narishige, IP). </li></ul> Microiniezione <ul><li> Preparare 20μl della miscela di iniezione:. 2.4μl gentamicina (Sigma-Aldrich G8648, 50mg/ml in soluzione salina) e 17.6μl 10-kDa lucifer giallo destrano (Invitrogen D1825, (1mg/ml in soluzione salina) Nel pesce controllare l' gentamicina viene sostituito con una soluzione salina. Il destrano fluorescente (molti colori diversi possono essere usati) è sufficiente a verificare l'esattezza di iniezione e selezionare le larve che sono stati iniettati con la nephrotoxicant. </li><li> Predisporre 2 30 millimetri Petri con 2 ml di olio minerale per l'immissione della miscela di iniezione e la miscela sotto controllo, per prevenire l'evaporazione delle soluzioni. </li><li> Preparare l'anestetico: 400 mg tricaine polvere (etil-m-amminobenzoato metanosolfonato SIGMA A-5040) 97,7 ml di acqua DD, 2,1 ml 1M Tris (pH 9). Regolare a pH 7. Conservare questa soluzione, nel congelatore, in aliquote di 4,2 ml. Per utilizzare tricaine come anestetico diluire 4,2 ml di soluzione madre tricaine in 100 ml di acqua E3 (Westerfield 1993) e lasciare a temperatura ambiente. </li></ul> I seguenti passaggi sono svolti nell'ambito di un microscopio da dissezione <ul><li> Rimuovere manualmente ogni chorions restante con una pinza sottile e anestetizzare il pesce zebra trasferendoli in piastre di Petri con tricaine riscaldato a temperatura ambiente. Zebrafish dovrebbero essere esposti a tricaine almeno 15 minuti prima di iniziare le microiniezioni. </li><li> Aprire la punta di un ago da iniezione con una lama di rasoio (VWR scientifico 55411-050). Tenere la lama con una leggera angolazione per creare una smussatura e taglio la punta tale da ottenere una apertura punta del diametro di circa 10-20μm. </li><li> Accendere, vuoto e aria dell'apparato microiniezione (World di strumenti di precisione Inc., PV820 pneumatici picopump). Inserire l'ago nel porta-aghi montati sulla base micromanipolatore e inclinazione (Strumenti di precisione Parola, Inc., modello M3301R, TB-1). </li><li> Per riempire l'ago, inserire una goccia (10μl) della soluzione da iniettare nel piatto 30 millimetri Petri riempite con olio minerale (Chimica Fisher, 0121-1). Girare il micromanipolatore manuale in modo da far immergere la punta dell'ago nella goccia di soluzione, impostare il picopump "hold / vent" interruttore "vent" ("sfogo" corrisponde a vuoto sul PV820), e riempire l'ago tirando soluzione dalla punta dell'ago. Ci vorrà qualche minuto, se la soluzione entra l'ago troppo veloce,questo significa che il diametro della punta è troppo grande, e le iniezioni non sarà accurato. Dopo che l'ago è riempito, impostare il picopump a "hold" ("hold" corrisponde a iniettare sul PV820). </li><li> Per calibrare l'ago, impostare il picopump "gated / temporizzata" interruttore "gated", premere il pedale per scaricare l'ago, e registrare il tempo necessario (secondi) per il menisco di viaggiare da una marcatura a quello successivo (1 mm Distanza totale). Ripetere 3 volte, prendere il tempo medio (in secondi), e dividere il valore per 30 (volume in nanolitri (nl) corrispondente a 1 mm di distanza lineare) per determinare il numero di millisecondi necessari per fornire 1 nl di soluzione. Regolare la manopola del periodo di gamma a questo numero, e spostare l'interruttore "gated / tempo" a 'tempo'. Ora il picopump è impostato per fornire un impulso 1nl di soluzione. </li><li> Rimuovere il piatto olio minerale e posizionare la piastra di Petri con le larve al microscopio. Gruppo il pesce al centro della scatola di Petri e messa a fuoco. </li><li> Posizionare la pipetta partecipazione nella microsiringa pompa manuale (MMP, strumenti di precisione World) sul lato opposto della microinjector, anticipo la sua punta alla piastra di Petri, e nel piano di messa a fuoco del microscopio. Piega con un angolo poco profondo, in modo che la punta della pipetta holding è toccare il fondo della scatola di Petri ed è vicino a orizzontale. Assicurarsi di non avere bolle d'aria nel sistema, che potrebbe rallentare i tempi di risposta e diminuire la precisione della MMP. </li><li> Cambia per un ingrandimento maggiore sul microscopio e utilizzare un ciglia superfine con maniglia (Ted Pella 113) per posizionare il pesce larvale lato dorsale verso il basso con il tuorlo molto vicino alla pipetta holding. Tenere il pesce larvale succhiando il tuorlo nella pipetta tenendo ruotando in senso antiorario l'unità micrometro controllo della pompa manuale microsiringa. Fare attenzione a non trasformare il micrometro troppo lontano, come il tuorlo può scoppiare se tirato troppo in profondità nella pipetta holding. Focus sulla formazione comune vena cardinale, che si trova sopra il tuorlo, appena sotto il periderm ed è il sito del flusso di sangue molto alto. Con il micromanipolatore dell'apparato iniezione, guidare l'ago nella vena sviluppo comune cardinali. È in genere necessario per tirare l'ago un po 'indietro dopo l'inserimento, in quanto la vena comune cardinale è molto superficiale. Iniettare 1nl della soluzione premendo il pedale, quindi rilasciare le larve dalla pipetta holding e restituirla all'acqua embrione. Questo è un passo critico, soprattutto la prima volta, perché richiede una certa pratica nel posizionamento del pesce e il controllo della pressione di aspirazione e l'impianto di perforazione. Se il tuorlo di un embrione sia correttamente tenuto con la pipetta holding, non rotolerà come l'ago entra. </li><li> Per verificare il successo della microiniezione, monitorare la presenza del giallo Lucifero destrano nel cuore del pesce zebra sotto un microscopio a fluorescenza. Il giallo Lucifero rimane visibile nel cuore per circa 20 minuti prima di dissiparsi nel sistema circolatorio Se la soluzione viene iniettata nefrotossici correttamente, entro 2 ore dall'iniezione si vedrà ben poco lucifer giallo destrano rimanendo nel sito di iniezione. Se la soluzione viene iniettata nel sacco vitellino, un po 'di Lucifero giallo destrano rimarrà al sito di iniezione. (Fig. 1). Ritorna il pesce e medie E3. </li><li> Due giorni dopo l'iniezione, le larve si sviluppano edema pericardico come conseguenza della ridotta funzionalità renale (Fig. 2). </li></ul> Parte 2: Fissazione e immunofluorescenza con Na + / K + ATPasi anticorpi (α-6F) <ul><li> A 4 dpf, mettere tra i 10 ei 15 zebrafish larvale in flaconcini di vetro 4ml (Weathon, 225.012) e fissarli negli anni Dent 1 ml (80% MeOH 20% DMSO) per 4 ore a temperatura ambiente. </li><li> Reidratare gli embrioni in un graduale MeOH / PBT (PBS con 0,5% Tween20) serie, 75:25 50:50, 25:75, 100% PBT, pipettaggio la soluzione fuori e l'aggiunta di nuova soluzione al flacone stesso (1 ml di soluzione per fiala), 20 minuti in ogni soluzione. Le larve non dovrebbe mai essere esposto all'aria, lasciare una piccola soluzione che copre le larve quando si cambia soluzioni. </li><li> Rimuovere e sostituire PBT 1 ml con la soluzione bloccante (PBS con l'1% di DMSO, 0,5% Tween20, 10% siero di capra normale) per 3 ore a 4 ° C su un nutator. </li><li> Trasferire le larve in una microcentrifuga 2 ml. Rimuovere il blocco siero e sostituirlo con 300μl anticorpo primario nella soluzione di incubazione (PBS con l'1% di DMSO, 0,5% Tween20, 2% siero di capra normale) notte a 4 ° C su un nutator. Noi utilizziamo un anticorpo monoclonale Na + / K + ATPasi anticorpi (α-6F, surnatante, studi sullo sviluppo Ibridoma Banca, Iowa) alla diluizione 1:25 </li><li> Rimuovere l'anticorpo primario e lavare 3 x 30 minuti con una soluzione di incubazione a temperatura ambiente. </li><li> Incubare con anticorpo secondario (capra anti-topo Cy3, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 155-165-003) diluito 1:500 in soluzione di incubazione per 2 ore aRT. </li><li> Lavare 3 x 30 minuti con PBT. </li></ul> Parte 3: embedding in plastica con JB-4 <ul><li> Disidratazione dei tessuti attraverso una serie graduata di etanolo (50%, 75%, 95%, 100% x 2), 10 minuti per passo. </li><li> Preparare la soluzione di infiltrazione: 25 ml di JB-4 Soluzione Embedding A (Polysciences 0226A) e 0.24g di catalizzatore (Polysciences 02.618). Ci vuole un po 'per il catalizzatore per sciogliere, circa 20-30 minuti. La soluzione può essere conservato a 4 ° C fino a 1 mese. </li><li> Decantare l'etanolo al 100% e sostituirlo con una soluzione di infiltrazione di plastica. Mettere le provette a 4 ° C su una rotatori e permettere infiltrazioni di procedere fino a quando il lavandino larve sul fondo della fiala di vetro. Questo processo richiede di solito circa 30 minuti. </li><li> Incorporare protocollo: Posizionare il vassoio di plastica tazza stampaggio (Polysciences, Inc. 16643A) sotto un microscopio da dissezione. Trasferire le larve, insieme con una soluzione di infiltrazione di coprire, nelle coppe. I mezzi di inclusione viene preparato in un tubo di plastica di piccole dimensioni. Normalmente incorporare 4-5 pesce alla volta, un pesce per ogni tazza. Preparare 5-6 ml di plastica embedding (1,2 ml di soluzione di embedding per ogni tazza), aggiungendo 35 l di JB-4 Embedding Soluzione "B" (Polysciences Inc. 0226B) per ogni ml di soluzione di infiltrazione. Aggiungere 35 ml di JB-4 Soluzione Embedding "B" (Polysciences Inc. 0226B) per ogni ml di soluzione di infiltrazione. Mescolare bene, pipettando su e giù con una plastica volte pipetta Pasteur diverse. Questo è importante perché se non mescolato bene i JB-4 non si polimerizza in modo corretto. Dopo 5 ml di plastica incasso è stato preparato, rimuovere plastica infiltrazioni provenienti da tutto campioni con una pipetta Pasteur. Riempire la tazza con l'incorporamento di plastica. La plastica deve fuoriuscita della coppa, per garantire una buona attaccamento del titolare blocco al modello. Per rilevare zebrafish tubuli renali, le sezioni trasversali sono i migliori. A tal fine, i pesci sono integrati verticalmente, a testa in giù. Con l'aiuto di un ciglio con maniglia o una pinza sottile, periodicamente la posizione del pesce in verticale, fino a quando la plastica è abbastanza duro che non si muovono dalla loro posizione. Ci vogliono circa 20-30 minuti. Poi, luogo del titolare EBH-2 Block (Polysciences Inc. 15.899) oltre le coppe e lasciare il vassoio a 4 ° C durante la notte. Quando polimerizzazione in completo, si può saltar fuori i blocchi come cubetti di ghiaccio. </li><li> Embedding protocollo alternativo per le larve più: Riempire gli stampi a metà con completa JB-4 e permettono di polimerizzare. Per i 15 stampi mm quadrati usiamo il JB-4 volume a 700μl di riempire lo stampo a metà strada. Quindi, aggiungere le larve JB-4 imbevuto di indurente per la pre-polimerizzato riempito a metà stampi. Orientare le larve con la testa rivolta verso il lato lungo dello stampo e allineare le larve in modo che il line up occhi (si può mettere 10 pesci in un unico stampo in una linea). Dopo il blocco è polimerizzato è possibile tagliare i bordi del blocco, girarlo in modo che il lato sia rivolto il coltello e colla per una plastica "Chuck" che si inserisce nel microtomo. Con questo metodo è possibile posizionare un gran numero di larve nello stesso blocco, centrato nella plastica, e pronto per sezioni. Cura deve essere presa orientare il blocco al coltello in modo che le sezioni equivalente di ogni pesce vengono prese in un'unica sezione. Questo può essere realizzato mentre sezionare attraverso gli occhi: cioè orientare il blocco in modo che le sezioni equivalente degli occhi sono presi per ogni pesce. Il risultato finale è che si può analizzare molti pesci in concomitanza su un vetrino da microscopio singolo. </li></ul> Parte 4: sezionamento <ul><li> Impostare il campione nel porta mandrino del microtomo (usiamo un Finesse Shandon Thermo Electro Corporation microtomo) </li><li> Impostare la diapositiva più calda a 45 ° C. </li><li> Versare acqua deionizzata in un bicchiere e posizionarlo vicino al microtomo </li><li> Prima di sezionamento, assicurarsi che il blocco è orientato in modo da ottenere perfetta sezioni trasversali del pesce. Le leve di regolazione testa di orientamento può essere ruotata consentendo quindi di posizionare la testa del campione con precisione al coltello. Iniziare a tagliare sezioni spesse attraverso la testa del pesce. Mentre sezionamento attraverso gli occhi, orientare il blocco in modo che le sezioni equivalente degli occhi sono presi per ogni pesce. Quando le pinne pettorali elencati nelle sezioni, cioè quando i tubuli pronephric inizio. Da questo punto, tagliate circa 32 4 sezioni um dal blocco. </li><li> Raccogliere le sezioni con una pinza e lasciate cadere nel bicchiere con l'acqua, senza toccare l'acqua con le pinze. La sezione si espanderà non appena colpisce la superficie dell'acqua, ora lo si può raccogliere in una diapositiva. Inserire il vetrino in acqua ad un angolo di 45 ° e l'approccio alla sezione con l'aiuto di un ciglio con manico, toccando solo i confini della sezione. </li><li> Incubare i vetrini su un vetrino più caldo fino a completa asciugatura. </li><li> Sezioni di immagine usando la microscopia confocale o epifluorescente. </li></ul> Parte 5: Res RappresentanteULT Quando eseguito correttamente, il pesce iniettato apparire come in figura 1, con poco destrano fluorescente (in questo caso Lucifero giallo) visibile nel cuore e nel sistema circolatorio. Se l'iniezione è troppo profonda, materiale iniettato può essere visto concentrata nel sacco vitellino, o il cuore può essere forata causando un eccessivo sanguinamento. Se la pipetta azienda è fatta correttamente, il pesce non rotolerà o spostare quando iniettato, e questo permetterà una iniezione più accurata. Inoltre, è importante assicurarsi di non avere bolle d'aria nel MMP, che rallenterebbe i tempi di risposta e diminuire la precisione del sistema. In generale, come conseguenza della nefrotossicità gentamicina, l'80% del pesce iniettato sviluppare edema pericardico (Fig. 2). Usiamo un sistema di classificazione basato fenotipo, in cui i pesci con edema moderato mostrano evidente edema pericardico, ma non gli altri fenotipi osservabile, mentre severamente pesce edematosa mostrano edema pericardico e tronco, con lieve a moderata curvatura asse. Utilizzando un anticorpo contro il tubulo renale Na + / K + ATPasi (α-6F) possiamo visualizzare i tubuli danneggiati nelle sezioni trasversali, con una evidente perdita di polarità delle cellule e interruzione tubolare in tubuli danneggiati rispetto ai controlli (Fig. 3). Questo fenomeno è presente attraverso molteplici sezioni trasversali. Al fine di ottenere un perfetto sezioni trasversali dei tubuli renali è importante posizionare correttamente il pesce durante la incorporamento. Quando si confrontano sezioni, pinne pettorali e tubuli contorti prossimali sono utilizzati come marcatori anatomici. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Microiniezione nefrotossina. (A) iniezione di successo di un 10kDa destrano coniugato con lucifer giallo, con espressione debole nella vena comune cardinale, freccia bianca. (B) di iniezione errato, con conseguente deposito di 10kDa destrano coniugato al giallo Lucifero che non dissipa nel sistema circolatorio, freccia rossa. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Gentamicina-mediata edema. (A) Controllo iniettato zebrafish larvale. Gentamicina iniettato zebrafish larvale con (B), moderata o (C), edema grave. Tutte le larve sono in 4 con dpf anteriore a sinistra e dorsale è alto. Frecce nere indicano edema pericardico in B e C. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. AKI immunoistochimica. α-6F colorazione anticorpi per Na + / K + ATPasi 48 ore post iniezione di gentamicina (4 larve DPF) nel controllo (A, B) e iniettato gentamicina (C, D) larve. A, C sono a 20X di ingrandimento e di B e D sono 3X ingrandimenti digitali dei tubuli destra in perdita Nota A e C. di polarità basolaterale e interruzione tubulo, freccia bianca, in D rispetto a B.

<ol><li>Hentschel, D. M., Park, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure+in+zebrafish%3A+a+novel+system+to+study+a+complex+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li>
<li>Majumdar, A., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+no+isthmus+reveals+a+role+for+pax2.1+in+tubule+differentiation+and+patterning+events+in+the+pronephric+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish no isthmus reveals a role for pax2.1 in tubule differentiation and patterning events in the pronephric primordia.</a> Development. 127 (10), 2089-2098 (2000).</li>
<li>Weinstein, B. M., Stemple, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gridlock%2C+a+localized+heritable+vascular+patterning+defect+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Gridlock, a localized heritable vascular patterning defect in the zebrafish.</a> Nat Med. 1 (11), 1143-1147 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University Oregon Press. Oregon. (1993).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo articolo abbiamo mostrato un video di tecnica di microiniezione per via endovenosa per un modello di danno renale acuto, con la creazione di gentamicina mediato danno del tubulo prossimale nelle larve zebrafish. Questo danno provoca la formazione di pericardico e / o edema lordo, che riflette l&#39;incapacità di regolare l&#39;equilibrio idrico. Abbiamo anche descritto un esperimento immunoistochimica con un anticorpo che segna tubuli renali differenziata (Majumdar et al. 2000), mostrando la perdita di polarità cellulare e una perturbazione del tubulo prossimale nei reni danneggiati. Microiniezioni per via endovenosa rappresentano un metodo efficiente per la consegna di una sostanza solubile nel sangue delle larve di zebrafish. Questa tecnica è un ottimo strumento per l&#39;introduzione di una varietà di sostanze e con l&#39;aiuto di un iniezioni marcatore fluorescente uniforme può essere ripetuto più volte consentendo risultati coerenti.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;6F monoclonale murino </td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portablocco EBH-2</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-6</td><td></td></tr><tr><td>Capillari R-6 in vetro su misura </td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3000</td><td></td></tr><tr><td>Polvere catalizzatrice</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618</td><td></td></tr><tr><td>Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>155-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Destrano 10k giallo lucifero, fissabile con lisina</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1825</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Ciglia</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8648</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi in vetro da 4 ml</td><td>Weathon</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di ferro</td><td>Narishige International</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di inclusione JB-4 A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di inclusione JB-4 B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore a joystick</td><td>Narishige International</td><td>MN 151</td><td></td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Narishige International</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Pompa microsiringa manuale</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio per microiniezione</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Shandon Finesse</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale leggero</td><td>Fisher Scientific</td><td>0121-1</td><td></td></tr><tr><td>Tiracapillari</td><td>Kopf Instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Vassoio per stampi in plastica</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>16643A</td><td></td></tr><tr><td>Lama da rasoio</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Scaldavetrini</td><td>Labline Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micrometro per banco </td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>94 W 9910</td><td></td></tr><tr><td>Basetta inclinabile</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TB 1</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina in polvere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6F</td><td>Microscopio stereoscopico</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205FA</td><td>Microscopio a fluorescenza</td></tr></tbody></table>

microiniezioni endovenosa di larve zebrafish allo studio danno renale acuto

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In questo articolo abbiamo video di descrivere un modello di zebrafish di AKI con gentamicina come nephrotoxicant. La tecnica consiste in microiniezioni per via endovenosa, il 2 zebrafish dpf. Questa tecnica rappresenta un metodo efficace e rapido per fornire sostanze solubili nel sangue delle larve di zebrafish, permettendo l&#39;iniezione di pesce 15-20 all&#39;ora. Oltre agli studi di AKI, questa tecnica microiniezione può essere utilizzato anche per altri tipi di studi sperimentali come l&#39;angiografia. Forniamo un protocollo dettagliato della tecnica di attrezzature necessarie per le misure visiva della funzione renale ridotta. In aggiunta, abbiamo anche dimostrare il processo di fissazione, immunoistochimica montare tutto con un pennarello tubulo renale, di inclusione e sezionamento del pesce zebra larvale. Abbiamo dimostrato che le larve di zebrafish iniettati con gentamicina mostrare caratteristiche morfologiche coerenti con AKI: edema, perdita di polarità delle cellule in cellule tubulari prossimali epiteliali, e la rottura morfologica del tubulo.

Descriviamo una tecnica di microinjecting l&#39;aminoglicoside, gentamicina, in 2 giorni dopo fetilization (DPF) larve di zebrafish per indurre danno renale acuto (AKI). Abbiamo anche descritto un metodo per intero immunoistochimica montaggio, plastica embedding e sezionamento delle larve di zebrafish per visualizzare il danno mediato AKI.

Microiniezioni endovenosa di larve Zebrafish allo Studio danno renale acuto

In questo articolo video descriviamo un modello di AKI nel pesce zebra utilizzando la gentamicina come agente nefrotossico. La tecnica consiste in microiniezioni endovenose...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare un modello di danno renale acuto nel pesce zebra utilizzando il glicoside AMG Gentamicina come nefrotossina. Questo viene ottenuto innanzitutto iniettando la gentamicina nella vena cardinale comune di larve di pesce zebra a due giorni dalla fecondazione. Il secondo passaggio della procedura consiste nel valutare i fenotipi emus in larve iniettate a quattro giorni dalla fecondazione.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'elaborare zebrafish a quattro giorni post-fecondazione per la colorazione di immunohistochemia con un anticorpo specifico per l'epitelio dei tubuli renali am. L'ultimo passaggio della procedura prevede il sezionamento degli zebrafish, larve, e la loro visualizzazione al fine di individuare tubuli danneggiati a causa della perdita di polarità cellulare e della compromissione della struttura tubulare. In definitiva, è possibile ottenere risultati che evidenziano segmenti di tubuli renali danneggiati mediante immunohistochemia con un anticorpo per l'epitelio renale.Ciao, sono Carala San Cosentino del laboratorio di Neil Hari del Dipartimento di Biologia dello Sviluppo dell'Università di Pittsburgh. Oggi vi mostreremo una procedura per microiniettare l'amminoglicoside Gentamicina in larve di pesce zebra a due giorni dalla fecondazione. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per indurre un danno renale acuto nelle larve di pesce zebra.Cominciamo. Iniziare accoppiando zebrafish adulti tre notti prima dell'esperimento previsto. Per ottenere embrioni allo stadio di due giorni dopo la fecondazione, preparare il mezzo E3 utilizzando cloruro di sodio 5 millimolare, cloruro di potassio 0,17 millimolare, cloruro di calcio 0,33 millimolare, solfato di magnesio 0,33 millimolare, raccogliere gli embrioni e collocarli in una piastra di Petri con acqua E3 riscaldata, in un incubatore a 28,5 gradi Celsius.Rimuovere dal piatto di Petri eventuali embrioni morti alla fine del primo giorno. Separare gli embrioni in gruppi di 80-100 per piatto di Petri. Preparare aghi di vetro per iniezione tirando tubi capillari fino a un diametro finale di circa 10-20 micron mediante un elettrodo per il tiraggio.Dopo il tiraggio, posizionare la capillare sotto un microscopio stereoscopico e utilizzare un righello per tracciare circa dieci linee di un millimetro lungo l'ago con un pennarello indelebile. Conservare gli aghi in una grande capsula di Petri su supporti di argilla. Successivamente, preparare la pipetta di ritenzione mediante riscaldamento a fiamma.Lucidatura della punta di una capillare in vetro borosilicato con pareti sottili. Tenere la capillare in vetro con pinze lunghe e riscaldare la punta posizionandola verticalmente sopra il cono interno di colore blu chiaro della fiamma per uno o due secondi. Ruotare la capillare per ottenere una fusione uniforme.Ripetere questa operazione alcune volte, quindi esaminare il capillare su un micrometro da banco. Il capillare dovrebbe avere un diametro compreso tra 0,4 e 0,5 millimetri. Dopo aver preparato i capillari e i supporti, riempire la siringa manuale per microinfusione con olio minerale seguendo le istruzioni fornite dal produttore.Inserire il supporto per micropipetta in un manipolatore joystick collegato tramite un supporto magnetico a una piastra di ferro. Preparare 20 microlitri della miscela di iniezione nefrotossica. 2,4 nanolitri di Gentamicina e 17,6 nanolitri di dextrano giallo Lucifer nel rva di controllo.La gentamicina viene sostituita con soluzione salina. Preparare due piastre di Petri da 30 millimetri con due millilitri di olio minerale vicino al microscopio per iniezione, per depositare le miscele nefrotossica e di controllo prima dell'iniezione. Preparare l'anestetico sciogliendo 400 milligrammi di polvere di trica in 97,7 millilitri di acqua bidistillata e 2,1 millilitri di tris uno molare, quindi regolare a pH sette.Conservare questa soluzione madre nel congelatore in Eloqua da 4,2 millilitri. Per utilizzare la trica come anestetico, diluire la soluzione madre di trica da 4,2 millilitri in 100 millilitri di E tre e lasciarla a temperatura ambiente. Per preparare le larve per l'iniezione sotto un microscopio stereoscopico, rimuovere manualmente le coons con pinzette fini. Anestetizzare le larve di pesce zebra trasferendole in una piastra di Petri contenente trica temperata a temperatura ambiente.I larve di zebrafish devono essere esposte al trica per almeno 15 minuti. Prima di iniziare le microiniezioni, aprire la punta dell'ago di iniezione utilizzando una lametta. Tenere la lametta leggermente inclinata per creare un bisellatura e tagliare la punta in modo da ottenere un'apertura di circa 10-20 micron di diametro.Accendere l'alimentazione e l'aria compressa per l'apparato di microiniezione. Inserire l'ago nel portaago. Riempire l'ago posizionando una goccia di 10 microlitri della soluzione da iniettare nella piastra di Petri contenente olio.Sotto il microscopio, accendere la pompa manuale a impulsi e immergere leggermente la punta dell'ago. Nella goccia, impostare la pompa a impulsi su sfiato per riempire l'ago. Questa operazione richiederà alcuni minuti.Se la soluzione entra nell'ago troppo velocemente, il diametro della punta è eccessivo e le iniezioni non saranno accurate. Dopo aver riempito l'ago, impostare la pompa pico sulla funzione di mantenimento per calibrare l'ago, quindi posizionare l'interruttore della pompa pico sulla modalità gated. Premere il pedale con il piede per scaricare l'ago e registrare il tempo, in secondi, necessario affinché il menisco si sposti da una marcatura di un millimetro alla successiva; ripetere l'operazione tre volte e dividere il tempo medio per 30, che corrisponde al volume in nanolitri associato alla distanza lineare di un millimetro, ottenendo così il numero di millisecondi necessari per erogare un nanolitro di soluzione.Regolare la manopola del periodo di intervallo su questo valore e spostare l'interruttore del tempo con porte su "temporizzato". Ora la pompa a risonanza è impostata per erogare un impulso di soluzione di un nanolitro. Successivamente, posizionare la piastra di Petri con le larve sotto il microscopio.Raggruppare le larve al centro della piastra di Petri e mettere a fuoco il microscopio. Posizionare la pipetta di ritenzione nella siringa manuale collegata alla micropompa sul lato opposto del micropipettatore e avanzare la sua estremit&agrave; fino alla piastra di Petri, portandola nel piano di messa a fuoco del microscopio. Curvarla con un angolo piuttosto lieve in modo che la punta della pipetta di ritenzione tocchi il fondo della piastra di Petri ed &egrave; prossima all'orizzontale.Passare a un ingrandimento più elevato al microscopio e utilizzare un ciglio super fine con manico. Posizionare il pesce zebra larvale con il lato dorsale rivolto verso il basso e il tuorlo molto vicino alla pipetta di ritenzione. Ruotare in senso antiorario il micrometro che controlla la pompa manuale della siringa per trattenere la larva del pesce zebra aspirando il tuorlo all'interno della pipetta di ritenzione.Attenzione a non ruotare troppo il micrometro, poiché il tuorlo potrebbe scoppiare. Se viene aspirato troppo in profondità nella pipetta di ritenzione, concentrarsi sulla vena cardinale comune in formazione, che si trova sopra il tuorlo appena al di sotto del periderma ed è un'area con un flusso sanguigno elevato. Utilizzando il micromanipolatore dell'apparato di iniezione.Guidare l'ago nella vena cardiaca comune in via di sviluppo. Di solito è necessario arretrare leggermente l'ago dopo l'inserimento, poiché la vena cardiaca comune è molto superficiale. Se il tuorlo della larva è correttamente trattenuto con la pipetta di fissaggio, non ruoterà durante l'ingresso dell'ago.Iniettare un nanolitro di soluzione premendo il pedale. Successivamente, rilasciare le larve dalla pipetta di contenimento e riporla nell'acqua per larve. Per verificare l'esito positivo della microiniezione, monitorare la presenza del dextrano giallo lucifero nel cuore delle larve di pesce zebra.Sotto un microscopio a fluorescenza, il Lucifer yellow rimane visibile nel sistema circolatorio per circa 20 minuti; reinserire le larve in mezzo E3 fresco a quattro giorni dalla fecondazione. Collocare tra 10 e 15 larve di pesce zebra in vial di vetro da quattro millilitri e fissarle in un millilitro di dents per quattro ore a temperatura ambiente. Reidratare le larve in metanolo in serie progressiva con P-B-T-P-B-S al 0,5%, passando da 20 a 75%, da 50 a 50%, da 25 a 75%, fino al 100% PBT, rimuovendo la soluzione con una pipetta e aggiungendo una nuova soluzione nello stesso vial.Un millilitro di soluzione per provetta. Ventiquattro minuti in ciascuna soluzione. I larve non devono mai essere esposte all'aria.Lasciare sempre una piccola quantità di soluzione a coprire le larve. Durante il cambio delle soluzioni, rimuovere il PBT e sostituirlo con un millilitro di soluzione di blocco PBS contenente 1% DMSO e 0,5% tra il 20 e il 10% di siero di capra normale, per tre ore a quattro gradi Celsius su un agitatore. Trasferire le larve in una eppendorf da due millilitri.Rimuovere il siero bloccante e sostituirlo con 300 microlitri di anticorpo primario. Un anticorpo monoclonale anti-sodio potassio ATPasi diluito 1:25 (clono α6F supernatante) e 300 microlitri di soluzione di incubazione PBS con 1% DMSO, 0,5% Tween 20 e 2% siero di capra normale, incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius su un agitatore. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare tre volte per 30 minuti ciascuno con un millilitro di soluzione di incubazione a temperatura ambiente, posizionando su un agitatore per ogni lavaggio.Quindi incubare con l'anticorpo secondario diluito uno a 500 nella soluzione di incubazione per due ore a temperatura ambiente. Dopo questo lavaggio, eseguire tre lavaggi di 30 minuti ciascuno con PBT, quindi disidratare le larve mediante una serie alcolica progressiva, lasciando in ammollo per 10 minuti per ogni passaggio. Preparare la soluzione di infiltrazione utilizzando 25 millilitri di soluzione di inclusione JB4 A e 0,24 grammi di catalizzatore, sciogliendo per 20-30 minuti. La soluzione può essere conservata a quattro gradi Celsius fino a un mese.Rimuovere l'etanolo al 100% e sostituirlo con la soluzione di infiltrazione plastica. Posizionare i tubi a quattro gradi Celsius su un agitatore rotante e lasciare procedere l'infiltrazione per circa 30 minuti, fino a quando le larve affonderanno sul fondo del tubo. Per incorporare le larve, posizionare il vassoio per stampi in plastica sotto un microscopio stereoscopico.Trasferire i larvi insieme a una quantità sufficiente di soluzione di infiltrazione per coprirli nelle coppette. Il mezzo di inclusione in plastica viene preparato in un piccolo tubo di plastica. Normalmente includiamo quattro o cinque larvi alla volta, utilizzando un larva per ogni coppetta, e prepariamo cinque millilitri di plastica per inclusione.Aggiungere 35 microlitri di JB quattro, soluzione di inclusione B, per ogni millilitro di soluzione di infiltrazione; mescolare bene aspirando e dispensando più volte con una pipetta di plastica o una pipetta per garantire una corretta polimerizzazione del JB quattro. Dopo aver preparato cinque millilitri di plastica per inclusione, rimuovere la plastica di infiltrazione dai campioni rotondi utilizzando una pipetta di plastica. Riempire la coppetta con la plastica di inclusione; la plastica deve fuoriuscire dalla coppetta per assicurare un buon fissaggio del portablocco al campione.Per rilevare i tubuli renali del pesce zebra, le sezioni trasversali sono le più adatte a questo scopo. Le larve devono essere incluse verticalmente, con la testa rivolta verso il basso, avvalendosi di una ciglio con manico o di pinzette fini.Posizionare periodicamente i larvi in verticale finché la plastica non sarà abbastanza dura da impedire loro di muoversi dalla posizione. Ci vogliono circa da 20 a 30 minuti. Successivamente, posizionare il supporto a due blocchi EVH sopra i contenitori e lasciare il vassoio a quattro gradi Celsius durante la notte fino al completamento della polimerizzazione.Posizionare il campione nel portamorsetto del microtomo e impostare il riscaldatore di vetrini a 45 gradi Celsius. Versare acqua deionizzata in un becher e posizionarlo vicino al microtomo prima della sezionatura. Assicurarsi che il blocco sia orientato in modo da ottenere sezioni trasversali perfette delle larve.Le leve di regolazione dell'orientamento della testa possono essere ruotate e la retroilluminazione nella posizionamento del campione. Tagliare sezioni spesse attraverso la testa. Orientare i blocchi in modo che vengano prelevate sezioni equivalenti degli occhi per ogni larva.Quando le pinne pettorali compaiono nelle sezioni, è in questo momento che iniziano i tubuli primitivi. Da questo punto, effettuare circa 32 sezioni di 4 micron dai blocchi. Raccogliere le sezioni con pinzette e lasciarle cadere nel becher con acqua senza toccare l'acqua con le pinzette.La sezione si espanderà non appena toccherà la superficie dell'acqua. Ora è possibile raccoglierla su un vetrino. Inserire il vetrino nell'acqua con un angolo di 45 gradi ed avvicinarsi alla sezione aiutandosi con una ciglio munito di manico, toccando soltanto i bordi della sezione. Incubare i vetrini su un riscaldatore per vetrini fino a completa essiccazione ed acquisire le immagini delle sezioni mediante microscopia epifluorescente o microscopia confocale.Quando eseguita correttamente, una larva iniettata appare come mostrato nell'immagine superiore, con il dextrano fluorescente giallo alla luciferasi presente nel sistema vascolare delle larve. Se l'iniezione è troppo profonda, come nell'immagine inferiore, il materiale iniettato può essere visto nel sacco vitellino oppure può verificarsi una perforazione del cuore che causa un sanguinamento eccessivo. Le larve hanno sviluppato edema pericardico come conseguenza della nefrotossicità indotta dalla gentamicina, come mostrato qui.I larve di controllo nella parte superiore non mostrano edema pericardico. Tuttavia, quando vengono iniettate con gentamicina, l'80% delle larve di pesce zebra mostra un edema moderato o grave, come indicato dalle frecce nei pannelli centrali e inferiori. Utilizziamo un sistema di classificazione basato sul fenotipo, in cui le larve con edema moderato presentano un evidente edema pericardico, ma nessun altro fenotipo osservabile.Mentre le larve gravemente edematose mostrano edema pericardico ed edema del tronco, assenza di circolazione nel tronco e una curvatura accessoria lieve a moderata utilizzando un anticorpo contro il tubulo renale diretto contro l'ATPasi sodio-potassio. I tubuli danneggiati sono visibili in sezioni trasversali, con una evidente perdita di polarità cellulare nei pannelli C e D e una rottura tubulare nei tubuli danneggiati rispetto ai controlli nei pannelli A e B. Questo schema si mantiene costante in molteplici sezioni trasversali durante il confronto tra sezioni. Le pinne factoriali e i tubuli contorti prossimali vengono utilizzati come marcatori anatomici.È stato appena mostrato come indurre un danno renale acuto nei larve di pesce zebra. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare aghi per iniezione con un diametro compreso tra 10 e 20 micrometri. Potrebbe essere necessario levigare con la fiamma alcune pipette di ritenzione per ottenere i lati appropriati, ma una volta ottenuta una pipetta adeguata, la si può semplicemente conservare poiché può durare per diverse sessioni di iniezione.Inoltre, è importante assicurarsi di non avere bolle d'aria nell'apparato micro series JA poiché ciò ridurrebbe la precisione del sistema. Infine, posizionare il pesce in verticale durante l'inclusione al fine di ottenere una sezione trasversale perfetta del tubulo renale. Ecco fatto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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