Microiniezioni endovenosa di larve Zebrafish allo Studio danno renale acuto

L'obiettivo generale di questa procedura è creare un modello di danno renale acuto nel pesce zebra utilizzando il glicoside AMG Gentamicina come nefrotossina. Questo viene ottenuto innanzitutto iniettando la gentamicina nella vena cardinale comune di larve di pesce zebra a due giorni dalla fecondazione. Il secondo passaggio della procedura consiste nel valutare i fenotipi emus in larve iniettate a quattro giorni dalla fecondazione.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'elaborare zebrafish a quattro giorni post-fecondazione per la colorazione di immunohistochemia con un anticorpo specifico per l'epitelio dei tubuli renali am. L'ultimo passaggio della procedura prevede il sezionamento degli zebrafish, larve, e la loro visualizzazione al fine di individuare tubuli danneggiati a causa della perdita di polarità cellulare e della compromissione della struttura tubulare. In definitiva, è possibile ottenere risultati che evidenziano segmenti di tubuli renali danneggiati mediante immunohistochemia con un anticorpo per l'epitelio renale.

Ciao, sono Carala San Cosentino del laboratorio di Neil Hari del Dipartimento di Biologia dello Sviluppo dell'Università di Pittsburgh. Oggi vi mostreremo una procedura per microiniettare l'amminoglicoside Gentamicina in larve di pesce zebra a due giorni dalla fecondazione. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per indurre un danno renale acuto nelle larve di pesce zebra.

Cominciamo. Iniziare accoppiando zebrafish adulti tre notti prima dell'esperimento previsto. Per ottenere embrioni allo stadio di due giorni dopo la fecondazione, preparare il mezzo E3 utilizzando cloruro di sodio 5 millimolare, cloruro di potassio 0,17 millimolare, cloruro di calcio 0,33 millimolare, solfato di magnesio 0,33 millimolare, raccogliere gli embrioni e collocarli in una piastra di Petri con acqua E3 riscaldata, in un incubatore a 28,5 gradi Celsius.

Rimuovere dal piatto di Petri eventuali embrioni morti alla fine del primo giorno. Separare gli embrioni in gruppi di 80-100 per piatto di Petri. Preparare aghi di vetro per iniezione tirando tubi capillari fino a un diametro finale di circa 10-20 micron mediante un elettrodo per il tiraggio.

Dopo il tiraggio, posizionare la capillare sotto un microscopio stereoscopico e utilizzare un righello per tracciare circa dieci linee di un millimetro lungo l'ago con un pennarello indelebile. Conservare gli aghi in una grande capsula di Petri su supporti di argilla. Successivamente, preparare la pipetta di ritenzione mediante riscaldamento a fiamma.

Lucidatura della punta di una capillare in vetro borosilicato con pareti sottili. Tenere la capillare in vetro con pinze lunghe e riscaldare la punta posizionandola verticalmente sopra il cono interno di colore blu chiaro della fiamma per uno o due secondi. Ruotare la capillare per ottenere una fusione uniforme.

Ripetere questa operazione alcune volte, quindi esaminare il capillare su un micrometro da banco. Il capillare dovrebbe avere un diametro compreso tra 0,4 e 0,5 millimetri. Dopo aver preparato i capillari e i supporti, riempire la siringa manuale per microinfusione con olio minerale seguendo le istruzioni fornite dal produttore.

Inserire il supporto per micropipetta in un manipolatore joystick collegato tramite un supporto magnetico a una piastra di ferro. Preparare 20 microlitri della miscela di iniezione nefrotossica. 2,4 nanolitri di Gentamicina e 17,6 nanolitri di dextrano giallo Lucifer nel rva di controllo.

La gentamicina viene sostituita con soluzione salina. Preparare due piastre di Petri da 30 millimetri con due millilitri di olio minerale vicino al microscopio per iniezione, per depositare le miscele nefrotossica e di controllo prima dell'iniezione. Preparare l'anestetico sciogliendo 400 milligrammi di polvere di trica in 97,7 millilitri di acqua bidistillata e 2,1 millilitri di tris uno molare, quindi regolare a pH sette.

Conservare questa soluzione madre nel congelatore in Eloqua da 4,2 millilitri. Per utilizzare la trica come anestetico, diluire la soluzione madre di trica da 4,2 millilitri in 100 millilitri di E tre e lasciarla a temperatura ambiente. Per preparare le larve per l'iniezione sotto un microscopio stereoscopico, rimuovere manualmente le coons con pinzette fini. Anestetizzare le larve di pesce zebra trasferendole in una piastra di Petri contenente trica temperata a temperatura ambiente.

I larve di zebrafish devono essere esposte al trica per almeno 15 minuti. Prima di iniziare le microiniezioni, aprire la punta dell'ago di iniezione utilizzando una lametta. Tenere la lametta leggermente inclinata per creare un bisellatura e tagliare la punta in modo da ottenere un'apertura di circa 10-20 micron di diametro.

Accendere l'alimentazione e l'aria compressa per l'apparato di microiniezione. Inserire l'ago nel portaago. Riempire l'ago posizionando una goccia di 10 microlitri della soluzione da iniettare nella piastra di Petri contenente olio.

Sotto il microscopio, accendere la pompa manuale a impulsi e immergere leggermente la punta dell'ago. Nella goccia, impostare la pompa a impulsi su sfiato per riempire l'ago. Questa operazione richiederà alcuni minuti.

Se la soluzione entra nell'ago troppo velocemente, il diametro della punta è eccessivo e le iniezioni non saranno accurate. Dopo aver riempito l'ago, impostare la pompa pico sulla funzione di mantenimento per calibrare l'ago, quindi posizionare l'interruttore della pompa pico sulla modalità gated. Premere il pedale con il piede per scaricare l'ago e registrare il tempo, in secondi, necessario affinché il menisco si sposti da una marcatura di un millimetro alla successiva; ripetere l'operazione tre volte e dividere il tempo medio per 30, che corrisponde al volume in nanolitri associato alla distanza lineare di un millimetro, ottenendo così il numero di millisecondi necessari per erogare un nanolitro di soluzione.

Regolare la manopola del periodo di intervallo su questo valore e spostare l'interruttore del tempo con porte su "temporizzato". Ora la pompa a risonanza è impostata per erogare un impulso di soluzione di un nanolitro. Successivamente, posizionare la piastra di Petri con le larve sotto il microscopio.

Raggruppare le larve al centro della piastra di Petri e mettere a fuoco il microscopio. Posizionare la pipetta di ritenzione nella siringa manuale collegata alla micropompa sul lato opposto del micropipettatore e avanzare la sua estremità fino alla piastra di Petri, portandola nel piano di messa a fuoco del microscopio. Curvarla con un angolo piuttosto lieve in modo che la punta della pipetta di ritenzione tocchi il fondo della piastra di Petri ed è prossima all'orizzontale.

Passare a un ingrandimento più elevato al microscopio e utilizzare un ciglio super fine con manico. Posizionare il pesce zebra larvale con il lato dorsale rivolto verso il basso e il tuorlo molto vicino alla pipetta di ritenzione. Ruotare in senso antiorario il micrometro che controlla la pompa manuale della siringa per trattenere la larva del pesce zebra aspirando il tuorlo all'interno della pipetta di ritenzione.

Attenzione a non ruotare troppo il micrometro, poiché il tuorlo potrebbe scoppiare. Se viene aspirato troppo in profondità nella pipetta di ritenzione, concentrarsi sulla vena cardinale comune in formazione, che si trova sopra il tuorlo appena al di sotto del periderma ed è un'area con un flusso sanguigno elevato. Utilizzando il micromanipolatore dell'apparato di iniezione.

Guidare l'ago nella vena cardiaca comune in via di sviluppo. Di solito è necessario arretrare leggermente l'ago dopo l'inserimento, poiché la vena cardiaca comune è molto superficiale. Se il tuorlo della larva è correttamente trattenuto con la pipetta di fissaggio, non ruoterà durante l'ingresso dell'ago.

Iniettare un nanolitro di soluzione premendo il pedale. Successivamente, rilasciare le larve dalla pipetta di contenimento e riporla nell'acqua per larve. Per verificare l'esito positivo della microiniezione, monitorare la presenza del dextrano giallo lucifero nel cuore delle larve di pesce zebra.

Sotto un microscopio a fluorescenza, il Lucifer yellow rimane visibile nel sistema circolatorio per circa 20 minuti; reinserire le larve in mezzo E3 fresco a quattro giorni dalla fecondazione. Collocare tra 10 e 15 larve di pesce zebra in vial di vetro da quattro millilitri e fissarle in un millilitro di dents per quattro ore a temperatura ambiente. Reidratare le larve in metanolo in serie progressiva con P-B-T-P-B-S al 0,5%, passando da 20 a 75%, da 50 a 50%, da 25 a 75%, fino al 100% PBT, rimuovendo la soluzione con una pipetta e aggiungendo una nuova soluzione nello stesso vial.

Un millilitro di soluzione per provetta. Ventiquattro minuti in ciascuna soluzione. I larve non devono mai essere esposte all'aria.

Lasciare sempre una piccola quantità di soluzione a coprire le larve. Durante il cambio delle soluzioni, rimuovere il PBT e sostituirlo con un millilitro di soluzione di blocco PBS contenente 1% DMSO e 0,5% tra il 20 e il 10% di siero di capra normale, per tre ore a quattro gradi Celsius su un agitatore. Trasferire le larve in una eppendorf da due millilitri.

Rimuovere il siero bloccante e sostituirlo con 300 microlitri di anticorpo primario. Un anticorpo monoclonale anti-sodio potassio ATPasi diluito 1:25 (clono α6F supernatante) e 300 microlitri di soluzione di incubazione PBS con 1% DMSO, 0,5% Tween 20 e 2% siero di capra normale, incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius su un agitatore. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare tre volte per 30 minuti ciascuno con un millilitro di soluzione di incubazione a temperatura ambiente, posizionando su un agitatore per ogni lavaggio.

Quindi incubare con l'anticorpo secondario diluito uno a 500 nella soluzione di incubazione per due ore a temperatura ambiente. Dopo questo lavaggio, eseguire tre lavaggi di 30 minuti ciascuno con PBT, quindi disidratare le larve mediante una serie alcolica progressiva, lasciando in ammollo per 10 minuti per ogni passaggio. Preparare la soluzione di infiltrazione utilizzando 25 millilitri di soluzione di inclusione JB4 A e 0,24 grammi di catalizzatore, sciogliendo per 20-30 minuti. La soluzione può essere conservata a quattro gradi Celsius fino a un mese.

Rimuovere l'etanolo al 100% e sostituirlo con la soluzione di infiltrazione plastica. Posizionare i tubi a quattro gradi Celsius su un agitatore rotante e lasciare procedere l'infiltrazione per circa 30 minuti, fino a quando le larve affonderanno sul fondo del tubo. Per incorporare le larve, posizionare il vassoio per stampi in plastica sotto un microscopio stereoscopico.

Trasferire i larvi insieme a una quantità sufficiente di soluzione di infiltrazione per coprirli nelle coppette. Il mezzo di inclusione in plastica viene preparato in un piccolo tubo di plastica. Normalmente includiamo quattro o cinque larvi alla volta, utilizzando un larva per ogni coppetta, e prepariamo cinque millilitri di plastica per inclusione.

Aggiungere 35 microlitri di JB quattro, soluzione di inclusione B, per ogni millilitro di soluzione di infiltrazione; mescolare bene aspirando e dispensando più volte con una pipetta di plastica o una pipetta per garantire una corretta polimerizzazione del JB quattro. Dopo aver preparato cinque millilitri di plastica per inclusione, rimuovere la plastica di infiltrazione dai campioni rotondi utilizzando una pipetta di plastica. Riempire la coppetta con la plastica di inclusione; la plastica deve fuoriuscire dalla coppetta per assicurare un buon fissaggio del portablocco al campione.

Per rilevare i tubuli renali del pesce zebra, le sezioni trasversali sono le più adatte a questo scopo. Le larve devono essere incluse verticalmente, con la testa rivolta verso il basso, avvalendosi di una ciglio con manico o di pinzette fini.

Posizionare periodicamente i larvi in verticale finché la plastica non sarà abbastanza dura da impedire loro di muoversi dalla posizione. Ci vogliono circa da 20 a 30 minuti. Successivamente, posizionare il supporto a due blocchi EVH sopra i contenitori e lasciare il vassoio a quattro gradi Celsius durante la notte fino al completamento della polimerizzazione.

Posizionare il campione nel portamorsetto del microtomo e impostare il riscaldatore di vetrini a 45 gradi Celsius. Versare acqua deionizzata in un becher e posizionarlo vicino al microtomo prima della sezionatura. Assicurarsi che il blocco sia orientato in modo da ottenere sezioni trasversali perfette delle larve.

Le leve di regolazione dell'orientamento della testa possono essere ruotate e la retroilluminazione nella posizionamento del campione. Tagliare sezioni spesse attraverso la testa. Orientare i blocchi in modo che vengano prelevate sezioni equivalenti degli occhi per ogni larva.

Quando le pinne pettorali compaiono nelle sezioni, è in questo momento che iniziano i tubuli primitivi. Da questo punto, effettuare circa 32 sezioni di 4 micron dai blocchi. Raccogliere le sezioni con pinzette e lasciarle cadere nel becher con acqua senza toccare l'acqua con le pinzette.

La sezione si espanderà non appena toccherà la superficie dell'acqua. Ora è possibile raccoglierla su un vetrino. Inserire il vetrino nell'acqua con un angolo di 45 gradi ed avvicinarsi alla sezione aiutandosi con una ciglio munito di manico, toccando soltanto i bordi della sezione. Incubare i vetrini su un riscaldatore per vetrini fino a completa essiccazione ed acquisire le immagini delle sezioni mediante microscopia epifluorescente o microscopia confocale.

Quando eseguita correttamente, una larva iniettata appare come mostrato nell'immagine superiore, con il dextrano fluorescente giallo alla luciferasi presente nel sistema vascolare delle larve. Se l'iniezione è troppo profonda, come nell'immagine inferiore, il materiale iniettato può essere visto nel sacco vitellino oppure può verificarsi una perforazione del cuore che causa un sanguinamento eccessivo. Le larve hanno sviluppato edema pericardico come conseguenza della nefrotossicità indotta dalla gentamicina, come mostrato qui.

I larve di controllo nella parte superiore non mostrano edema pericardico. Tuttavia, quando vengono iniettate con gentamicina, l'80% delle larve di pesce zebra mostra un edema moderato o grave, come indicato dalle frecce nei pannelli centrali e inferiori. Utilizziamo un sistema di classificazione basato sul fenotipo, in cui le larve con edema moderato presentano un evidente edema pericardico, ma nessun altro fenotipo osservabile.

Mentre le larve gravemente edematose mostrano edema pericardico ed edema del tronco, assenza di circolazione nel tronco e una curvatura accessoria lieve a moderata utilizzando un anticorpo contro il tubulo renale diretto contro l'ATPasi sodio-potassio. I tubuli danneggiati sono visibili in sezioni trasversali, con una evidente perdita di polarità cellulare nei pannelli C e D e una rottura tubulare nei tubuli danneggiati rispetto ai controlli nei pannelli A e B. Questo schema si mantiene costante in molteplici sezioni trasversali durante il confronto tra sezioni. Le pinne factoriali e i tubuli contorti prossimali vengono utilizzati come marcatori anatomici.

È stato appena mostrato come indurre un danno renale acuto nei larve di pesce zebra. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare aghi per iniezione con un diametro compreso tra 10 e 20 micrometri. Potrebbe essere necessario levigare con la fiamma alcune pipette di ritenzione per ottenere i lati appropriati, ma una volta ottenuta una pipetta adeguata, la si può semplicemente conservare poiché può durare per diverse sessioni di iniezione.

Inoltre, è importante assicurarsi di non avere bolle d'aria nell'apparato micro series JA poiché ciò ridurrebbe la precisione del sistema. Infine, posizionare il pesce in verticale durante l'inclusione al fine di ottenere una sezione trasversale perfetta del tubulo renale. Ecco fatto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.