Editing genomico CRISPR all-in-one: un metodo per il knock-in genico basato sulla riparazione diretta dall'omologia in cellule coltivate utilizzando il sistema CRISPR-Cas9

Inizia aggiungendo il plasmide CRISPR all-in-one alle cellule immunitarie presenti in una provetta. Questo plasmide contiene un gene Cas9 in combinazione con l'sgRNA o la sequenza codificante l'RNA a guida singola, complementare alla sequenza bersaglio nel genoma ospite.

Aggiungere un plasmide donatore linearizzato contenente un transgene inserito tra bracci di omologia o HA, le ripetizioni del DNA necessarie per la ricombinazione omologa. Eseguire l'elettroporazione, che utilizza la corrente elettrica per iniettare la miscela plasmidica nella cellula. Una volta all'interno, l'sgRNA processato forma un complesso con la nucleasi Cas9 espressa.

L'sgRNA si lega al sito bersaglio, consentendo alla nucleasi Cas9 di identificare la specifica sequenza di riconoscimento nota come motivo adiacente al protospaziatore o PAM e di scindere il DNA ospite vicino ad esso. Questo crea una rottura a doppio filamento smussata in cui il macchinario cellulare reseca il DNA, generando sporgenze di 3'. La presenza di siti di fiancheggiamento dell'HA innesca il meccanismo di riparazione diretto dall'omologia in cui il DNA tagliato si unisce alla sequenza di HA, formando una struttura eteroduplex - il D-loop.

La sintesi del DNA continua, formando un filamento complementare alla sequenza transgenica fino a quando non si ricongiunge al filamento di DNA originale. La parte superiore del D-loop funge da modello per sintetizzare la parte mancante del DNA, generando le doppie giunzioni di Holliday, strutture in cui interagiscono quattro filamenti di DNA. Queste giunzioni si risolvono e le lacune si riparano, facilitando l'inserimento del gene bersaglio.