Name: Nella visualizzazione in vivo delle vescicole sinaptiche In Drosophila assoni larvali segmentale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Scopri la visualizzazione in vivo delle vescicole sinaptiche in assoni larvali di Drosophila utilizzando proteine GFP. Questo metodo consente di studiare il trasporto assonale e le malattie neurologiche.

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SG è sostenuto da fondi del State University di New York a Buffalo e da John R. Oishei Foundation. MK è stato sostenuto da un premio di ricerca da parte degli studenti CURCA UB.

1. Preparazione dei reagenti <ol><li> Preparare la preparazione del buffer dissezione aggiungendo i seguenti composti: 128 mM NaCl, 1mM EGTA, 4 mM MgCl 2, 2mM KCl, HEPES 5mm, e 36 mM saccarosio nel 1000 mL, PH a 7,2 e filtro sterilizzare. </li></ol> 2. Preparazione per la dissezione <ol><li> Cubo Siligard: Il gel viene tagliato a circa un centimetro di larghezza, 1 pollice di lunghezza e circa 1 cm di altezza. Il cubo di gel viene posto su un vetrino durante la dissezione. Cubi possono essere utilizzati più di una volta. </li><li> Pin: pin utilizzati per la dissezione bisogno di essere più breve. La parte inferiore tagliente di pin minutien funziona meglio in dissezione. </li><li> Bisogno di un forte forbici primavera microdissezione. </li><li> Hai bisogno di due pinze a punta sottile. </li></ol> 3. Raccolta delle larve <ol><li> Vagando 3 ° larve instar che stanno esprimendo un tag vescicola proteina GFP sono raccolti su una piastra di Petri. </li><li> Le larve vengono lavati in acqua deionizzata per sbarazzarsi di tutto il cibo. </li></ol> 4. Dissezione dal vivo di larve <ol><li> Una larva è trasferito al cubo dissezione gel su un vetrino. Larva è immerso nel buffer dissezione. </li><li> Larva si struggeva al anteriore e posteriore con due perni bene con la parte dorsale fino. </li><li> Utilizzando le forbici microdissezione, un piccolo taglio viene effettuato presso la linea mediana verso la fine posteriore. Da questa incisione è fatta un taglio fino al anteriore. Utilizzando due pin, pin, la cuticola taglio sui bordi laterali. </li><li> Aggiungere una goccia di dissezione buffer. Rimuovere con attenzione l'intestino, intestino e organi di grasso con una pinza. La maggior parte di questi tessuti normalmente fuoriuscita durante il taglio dorsale. </li><li> Sostituire il buffer con fresca tampone dissezione. La larva non deve mai essere asciutto e deve essere costantemente in dissezione buffer. </li><li> Incubazioni utilizzando in vivo MitoTracker marcatori o LysoTracker sono fatte in questo momento, diluendo il marcatore in vivo nel buffer di dissezione. Dopo l'incubazione del marcatore in vivo lavare la larva sezionato diverse volte (5 lavaggi rapido) con ingredienti freschi buffer di dissezione. </li><li> Dopo aver sostituito l'ultimo lavaggio spingere i perni nel syligard e subito coprioggetto. Le larve è ora pronto per l'osservazione. </li></ol> 5. Immagini dal vivo di larve sezionato <ol><li> Posizionare il coprioggetto e gel sul palco microscopio e l'immagine utilizzando un microscopio invertito. </li><li> Noi usiamo una lente a 100x vescicole immagine tag all'interno larvale nervi segmentale. Espressione GFP nei corpi delle cellule del ganglio ventrale viene prima valutato prima di nervi segmentali sono ripreso. Se la colorazione GFP robusta è osservata nel corpo cellulare nel ganglio ventrale, i nervi sono poi fotografato e usato per la valutazione. </li><li> Utilizzando un sistema dual vista con filtri per CFP / YFP o RFP / YFP e visualizzare i software divisi possiamo simultaneamente immagine due proteine ​​tag in vivo. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1:. Un'immagine rappresentante che mostra molte vescicole assonale su molte piste assonale in un nervo larvale segmentale Notare le macchie di GFP, che rappresentano accumuli assonale. <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Una immagine rappresentativa che mostra una singola traccia assonale con molte vescicole assonale all'interno di un nervo larvale segmentale.

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144, 1075-1085 (1996).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In imaging in vivo di trasporto all&#39;interno delle vescicole sinaptiche Drosophila nervi larvale segmentale è un potente strumento per studiare i meccanismi di trasporto assonale. Abbiamo già utilizzato questo protocollo per valutare le dinamiche di trasporto all&#39;interno di nervi larvale esprimere ampliato ripete polyQ per chiarire come l&#39;espansione delle ripetizioni condizionare le dinamiche del trasporto delle vescicole 3. Utilizzando questo protocollo la velocità di mo...

<table><tbody><tr><td>1 paio di forbici da dissezione microchirurgiche</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Forbici a molla &amp;#8211; lama da 6 mm. Diametro della punta di 0,125 mm</td></tr><tr><td>2 paia di pinzette</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Pinzette da dissezione Fisherbrand Micro-Adson con punta seghettata</td></tr><tr><td>Scatola di spilli da dissezione</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Spilli Minutien con diametro di 0,1 mm</td></tr></tbody></table>

nella visualizzazione in vivo delle vescicole sinaptiche in drosophila assoni larvali segmentale

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Chiarire i meccanismi di trasporto assonale ha dimostrato di essere molto importante nel determinare come i difetti nel trasporto a lunga distanza influenzare diverse malattie neurologiche. Difetti in questo processo essenziale può avere effetti negativi sul funzionamento dei neuroni e lo sviluppo. Abbiamo sviluppato un protocollo di dissezione che è stato progettato per esporre la<em&gt; Drosophila</em&gt; Nervi larvale segmentale per visualizzare trasporto assonale in tempo reale. Abbiamo adattato questo protocollo per l&#39;imaging dal vivo da quello pubblicato da Hurd e Saxton (1996) utilizzata per immunolocalizatin larvale di nervi segmentale. Dissezione attenta e condizioni di buffer corretta è fondamentale per massimizzare la durata della vita delle larve sezionato. Se correttamente eseguita, larve sezionato hanno dimostrato di trasporto robusta vescicole per 2-3 ore in condizioni fisiologiche. Usiamo il metodo UAS-GAL4<sup&gt; 1</sup&gt; Per esprimere la GFP-tagged APP o vescicole synaptotagmin all&#39;interno di un singolo assone o assoni molti larvale nervi segmentali utilizzando diversi neuronali GAL4 driver. Altri marcatori fluorescenti tag, per esempio mitocondri (MitoTracker) o lisosomi (LysoTracker), può essere applicato anche alle larve prima di visualizzarlo. GFP-vescicola movimento e il movimento delle particelle possono essere visualizzati contemporaneamente con lunghezze d&#39;onda separate.

Questo protocollo descrive la dissezione dal vivo di<em&gt; Drosophila</emLarve&gt; allo scopo di immagini del movimento di GFP vescicole tag assonale sulle piste microtubuli.

Nella visualizzazione in vivo delle vescicole sinaptiche In Drosophila assoni larvali segmentale

L'elucidazione dei meccanismi del trasporto assonale si è dimostrata di fondamentale importanza per determinare in che modo i difetti nel trasporto a lunga distanza influenzino diversi...

Per studiare se siano presenti difetti nel trasporto assonico a lunga distanza in malattie neurologiche come la malattia di Alzheimer o la malattia di Huntington. Il trasporto assonico di vescicole di trasporto viene visualizzato in larve esofagee vive. Qui la meraviglia.Terzo stadio larvale in cui larve che esprimono una proteina fisica marcata con GFP vengono dissezionate su un cubetto di gel, quindi trasferite al microscopio per l'acquisizione di immagini in vivo. Successivamente, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per seguire il trasporto delle vescicole sinaptiche all'interno dell'assone. Il principale vantaggio dell'utilizzo di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti consiste nella visualizzazione del movimento vivo e ininterrotto delle vescicole sinaptiche e degli assoni larvali.Prepararsi per la dissezione assicurandosi che i seguenti materiali e reagenti siano a portata di mano. Buffer per dissezione. Un cubo di Sill guard ritagliato di un pollice di larghezza, un pollice di lunghezza e un centimetro di altezza, posizionato su un vetrino.Puntine da dissezione extra corte. La parte inferiore appuntita delle puntine manum è la più adatta per la dissezione. La

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Ricerca

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Neuroscience

Neuroscienze

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Visualizzazione di Live Drosophila Gliali-giunzione neuromuscolare con tinture fluorescenti

Larve di Drosophila melanogaster fornire un sistema modello ideale per studiare i meccanismi di trasporto assonale in nervi larvale segmentale. Utilizzando questa procedura, 3 ° larve instar portatori di mutazioni varie può essere paragonato a larve wild-type.

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Visualizzazione del sistema nervoso embrionale in Whole-mount Drosophila Embrioni

Questo protocollo descrive un metodo affidabile per l'anestesia e l'imaging di...

Imaging in vivo di intatto Larve di Drosophila a livello sub-cellulare Risoluzione

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Questo video dimostra un protocollo per studiare il riciclaggio delle vescicole sinaptiche alle giunzioni neuromuscolari nelle larve di Drosophila che esprimono canalrodopsina utilizzando un colorante fluorescente. La luce blu attiva le canalrodopsine, causando l'afflusso di calcio e l'esocitosi delle vescicole sinaptiche. Il colorante si integra nelle membrane neuronali e viene internalizzato durante l'endocitosi, con conseguente miglioramento della fluorescenza. Un'ulteriore stimolazione...

Analisi del riciclaggio delle vescicole sinaptiche e dell'assorbimento del colorante fluorescente nelle larve di Drosophila

Fonte: Jeong, S. Visualizzazione del modello di proiezione assonale dei motoneuroni embrionali in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Questo video dimostra la visualizzazione delle proiezioni assonali negli embrioni  Drosophila. L'immunomarcatura dei motoneuroni, la dissezione precisa per esporre le strutture neuronali e la microscopia a contrasto interferenale-differenziale rivelano collettivamente un'architettura neuronale dettagliata, enfatizzando i modelli di proiezione assonale.

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L'immunocolorazione è una tecnica efficace per visualizzare specifici tipi di cellule e proteine all'interno dei tessuti. Utilizzando la sonicazione, il protocollo qui descritto allevia la necessità di sezionare i tessuti di Drosophila melanogaster da embrioni e larve in fase avanzata prima dell'immunocolorazione. Forniamo una metodologia efficiente per l'immunocolorazione di larve intere di montatura fissate con formaldeide.

Sonicazione-facilitato immunofluorescenza colorazione di ritardo-fase embrionale e larvale<em&gt; Drosophila</em&gt; Tessuti<em&gt; In Situ</em

Questo lavoro descrive un metodo immunohistochemistico standard per visualizzare le proiezioni dei neuroni motori degli embrioni di Drosophila melanogaster a tarda fase 16. La preparazione filettata di embrioni fissi macchiati con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per caratterizzare i geni richiesti per la ricerca del percorso dell'assone motore e il riconoscimento del bersaglio durante lo sviluppo neurale.

Visualizzazione del modello di proiezione Axonal dei motoni embrionali in<em&gt; Drosophila</em

Qui illustriamo come microscopia di localizzazione foto-attivata di singola molecola può essere effettuata sul terminale del nervo motore di un live Drosophila melanogaster terzo instar larva.

In Vivo Singola molecola Tracking al terminale presinaptico nervo motore Drosophila

Scopri la visualizzazione in vivo delle vescicole sinaptiche in assoni larvali di Drosophila utilizzando proteine GFP. Questo metodo consente di studiare il trasporto assonale e le malattie neurologiche.

Nella visualizzazione in vivo delle vescicole sinaptiche In Drosophila assoni larvali segmentale

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