Nella visualizzazione in vivo delle vescicole sinaptiche In Drosophila assoni larvali segmentale
15 ottobre 2010
Questo protocollo descrive la dissezione dal vivo di Drosophila allo scopo di immagini del movimento di GFP vescicole tag assonale sulle piste microtubuli.
Per studiare se siano presenti difetti nel trasporto assonico a lunga distanza in malattie neurologiche come la malattia di Alzheimer o la malattia di Huntington. Il trasporto assonico di vescicole di trasporto viene visualizzato in larve esofagee vive. Qui la meraviglia.
Terzo stadio larvale in cui larve che esprimono una proteina fisica marcata con GFP vengono dissezionate su un cubetto di gel, quindi trasferite al microscopio per l'acquisizione di immagini in vivo. Successivamente, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per seguire il trasporto delle vescicole sinaptiche all'interno dell'assone. Il principale vantaggio dell'utilizzo di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti consiste nella visualizzazione del movimento vivo e ininterrotto delle vescicole sinaptiche e degli assoni larvali.
Prepararsi per la dissezione assicurandosi che i seguenti materiali e reagenti siano a portata di mano. Buffer per dissezione. Un cubo di Sill guard ritagliato di un pollice di larghezza, un pollice di lunghezza e un centimetro di altezza, posizionato su un vetrino.
Puntine da dissezione extra corte. La parte inferiore appuntita delle puntine manum è la più adatta per la dissezione. La lunghezza corretta può essere ottenuta inserendo puntine più lunghe nel gel e tagliando la parte che sporge.
Sarà inoltre necessaria una coppia di forbici a molla per microdissezione, affilate, e due paia di pinzette fini. Utilizzare una spatola metallica piccola per trasferire larve di terzo stadio in stadio di stella che esprimono una proteina SLE marcata con GFP in una piastra di Petri.
Successivamente, applicare acqua deionizzata alle larve nella piastra di Petri per rimuovere tutto il cibo. Quindi, utilizzando pinzette, trasferirle su un cubo di gel per dissezione per eseguire la dissezione su organismo vivo. Utilizzare le pinzette per trasferire una larva sul cubo di gel per dissezione.
Su un vetrino di vetro, aggiungere il buffer di dissezione al vetrino per immergerlo. Successivamente, fissare la larva alle estremità anteriore e posteriore con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Utilizzando forbici per microdissezione, effettuare un piccolo taglio lungo la linea mediana in prossimità dell'estremità posteriore.
Da questa incisione, effettuare un altro taglio fino alla regione anteriore. Gli intestini e i corpi adiposi fuoriescono utilizzando due spilli. Fissare l'esoscheletro tagliato ai bordi laterali del cubo di sughero.
Usare una pipetta per aggiungere una goccia di buffer per dissezione. Quindi, utilizzando pinzette, rimuovere con cura gli intestini e i corpi adiposi. Applicare un fazzoletto di carta kimwipe su un lato della larva per rimuovere il buffer, aggiungendo contemporaneamente buffer fresco per dissezione mediante pipetta.
La lava non deve mai essere secca. Per etichettare le strutture mitocondriali o lisosomiali nella lava, sostituire il buffer di dissezione con buffer di dissezione contenente mito tracker o lyo tracker. Posizionare il cubo di dissezione in una camera quadrata umidificata e coprirlo con carta d'alluminio.
Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione con il marcatore in vivo, aspirare ripetutamente il buffer di dissezione presente attorno alle larve e aggiungere altro buffer di dissezione mediante pipetta. Ripetere questo passaggio cinque volte per rimuovere qualsiasi marcatore residuo.
Dopo aver sostituito l'ultimo lavaggio, inserire completamente i perni nel supporto S e posizionare immediatamente un coprioggetto per evitare il movimento della larva. La larva è ora pronta per l'osservazione al fine di eseguire l'immagine in tempo reale della larva dissezionata. Posizionare il campione sul portacampioni di un microscopio invertito per acquisire immagini di vescicole marcate.
All'interno dei nervi segmentali larvali. Eseguire l'acquisizione delle immagini utilizzando un obiettivo da 100 volte. Se la colorazione GFP è intensa, si osserva nei corpi cellulari del ganglio ventrale e nei nervi segmentali mediante un sistema a doppia visione con filtri per C-F-P-Y-F-P o R-F-P-Y-F-P e un software di suddivisione dell'immagine; in questo modo due proteine marcate in vivo possono essere visualizzate contemporaneamente.
In questa serie a intervalli temporali si osservano molte vescicole assonali su numerosi tratti assonali all'interno di un nervo segmentale larvale. Si noti che la GFP, che rappresenta accumuli assonali, evidenzia anche il movimento bidirezionale delle vescicole. Qui si osserva il movimento di vescicole assonali su un singolo tratto all'interno di un nervo segmentale larvale.
Notare che il movimento bidirezionale di questi sles è in media di un micrometro al secondo. Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire una dissezione accurata per l'osservazione in vivo di vescicole marcate con GFP e assoni larvali gsof.
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Panoramica
Questo protocollo descrive la dissezione in vivo di larve di Drosophila per l'analisi dell'immagine del movimento di vescicole assonali marcate con GFP lungo tracce di microtubuli. Questa tecnica consente la visualizzazione del movimento vivo e ininterrotto di vescicole sinaptiche all'interno degli assoni larvali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Tecniche di imaging
Sfondo
- Il trasporto assonale è fondamentale per la funzione neuronale.
- I difetti del trasporto assonale sono associati a malattie neurologiche.
- Le larve di Drosophila costituiscono un organismo modello per lo studio di questi processi.
- La microscopia a fluorescenza consente l'osservazione in tempo reale del movimento delle vescicole.
Scopo dello studio
- Studiare i difetti del trasporto assonale a lunga distanza.
- Comprendere le implicazioni di questi difetti nelle malattie neurologiche.
- Utilizzare tecniche di imaging in tempo reale per un'osservazione migliorata.
Metodi Utilizzati
- Dissezione di larve di Drosophila che esprimono proteine marcate con GFP.
- Trasferimento delle larve dissezionate su un cubo di gel per garantire stabilità.
- Acquisizione di immagini in vivo mediante microscopia a fluorescenza.
- Tracciamento del trasporto delle vescicole all'interno degli assoni.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita del trasporto assonale in larve vive.
- Dimostrazione del movimento di vescicole marcate con GFP.
- Informazioni sulle dinamiche del trasporto delle vescicole sinaptiche.
- Il confronto con i metodi esistenti evidenzia i vantaggi di questo approccio.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce uno strumento prezioso per lo studio del trasporto assonale.
- L'immagine in tempo reale rivela informazioni fondamentali sul funzionamento neuronale.
- Questo metodo può essere applicato per indagare diverse condizioni neurologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Comprendere la dinamica del trasporto assonale è fondamentale per ridurre i rischi associati ai bersagli delle malattie neurodegenerative, poiché i difetti nel traffico delle vescicole sono legati meccanicamente all'Alzheimer, all'Huntington e alla SLA. Questo modello di assona larvale di Drosophila permette la visualizzazione in tempo reale del movimento delle vescicole sinaptiche, fornendo un sistema predittivo e pertinente alla malattia per la validazione precoce dei bersagli e per approfondimenti meccanicistici. Quantificando il flusso bidirezionale delle vescicole e le velocità di trasporto, il metodo supporta decisioni di tipo go/no-go nei programmi preclinici incentrati sull'integrità assonale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione del trasporto di vescicole marcate con GFP-APP o sinaptotagmina in assoni vivi.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale delle target attraverso l'osservazione diretta della dinamica vescicolare in un sistema geneticamente modificabile.
- Valore predittivo: Favorisce la riduzione del rischio meccanicistico collegando i difetti del trasporto alla disfunzione neuronale in modelli di malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi assonali validati per lo screening di composti, stabilendo una condizione di base per la motilità delle vescicole in condizioni fisiologiche.
- Valore operativo: Fornisce letture quantitative e riproducibili del movimento vescicolare (ad esempio, flusso bidirezionale di 1 µm/s) per la standardizzazione del saggio.
- Valore strategico: Consente flussi di lavoro di imaging scalabili e compatibili con piattaforme, per valutare gli effetti dei composti sul trasporto assonale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Si allinea a sistemi rilevanti per le malattie modellando difetti del trasporto osservati in condizioni neurodegenerative umane.
- Valore operativo: Consente un percorso continuo dalla scoperta alla validazione preclinica mediante imaging in tempo reale del trasporto delle vescicole in nervi larvali integri.
- Controllo del rischio: Guida le decisioni di avanzamento quantificando il ripristino o il peggioramento del trasporto indotto da modulatori candidati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel continuum dalla scoperta alla fase preclinica, sostenendo la verifica delle ipotesi nella fase iniziale della scoperta, la prontezza del saggio nello screening e la validazione meccanicistica nelle fasi precliniche.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici e la riduzione del rischio biologico mediante la visualizzazione del trasporto delle vescicole in risposta a perturbazioni genetiche o farmacologiche.
- Screening: Permette la prontezza del saggio grazie a protocolli standardizzati di dissezione, colorazione e acquisizione delle immagini, che forniscono metriche costanti sulla motilità vescicolare.
- Analisi: Genera misurazioni quantitative di variabili dipendenti (velocità, direzionalità, flusso) che consentono il confronto tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando difetti del trasporto assonale rilevanti per le malattie neurologiche umane.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging riutilizzabile per studi longitudinali sull'integrità assonale in diverse classi di bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi attraverso la visualizzazione diretta della dinamica delle vescicole sinaptiche.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità grazie a condizioni definite del buffer di dissezione e parametri di imaging.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo riducendo l'ambiguità meccanicistica nelle ipotesi sul trasporto assonale.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta del rischio degli obiettivi in base all'efficacia del recupero del trasporto in modelli pertinenti per la malattia.
Considerazioni per l'Implementazione
- Richiede competenze nel manipolaggio di Drosophila, nella microdissezione e nella microscopia a fluorescenza.
- Richiede un microscopio invertito dotato di obiettivo 100x, sistema dual-view e set di filtri appropriati per GFP e altri fluorofori.
- Necessita della standardizzazione del buffer di dissezione, dello stadio larvale e dei controlli ambientali (camera umidificata, temperatura).
- Le considerazioni per l'adattamento includono l'espressione di diversi carichi marcati con GFP (ad esempio, mitocondri, lisosomi) mediante driver GAL4 neuronali.
- I limiti pratici comprendono il tempo di preparazione delle larve e la finestra di 2–3 ore per un trasporto vescicolare robusto dopo la dissezione.
