Name: Nella visualizzazione in vivo delle vescicole sinaptiche In Drosophila assoni larvali segmentale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Scopri la visualizzazione in vivo delle vescicole sinaptiche in assoni larvali di Drosophila utilizzando proteine GFP. Questo metodo consente di studiare il trasporto assonale e le malattie neurologiche.

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SG è sostenuto da fondi del State University di New York a Buffalo e da John R. Oishei Foundation. MK è stato sostenuto da un premio di ricerca da parte degli studenti CURCA UB.

1. Preparazione dei reagenti <ol><li> Preparare la preparazione del buffer dissezione aggiungendo i seguenti composti: 128 mM NaCl, 1mM EGTA, 4 mM MgCl 2, 2mM KCl, HEPES 5mm, e 36 mM saccarosio nel 1000 mL, PH a 7,2 e filtro sterilizzare. </li></ol> 2. Preparazione per la dissezione <ol><li> Cubo Siligard: Il gel viene tagliato a circa un centimetro di larghezza, 1 pollice di lunghezza e circa 1 cm di altezza. Il cubo di gel viene posto su un vetrino durante la dissezione. Cubi possono essere utilizzati più di una volta. </li><li> Pin: pin utilizzati per la dissezione bisogno di essere più breve. La parte inferiore tagliente di pin minutien funziona meglio in dissezione. </li><li> Bisogno di un forte forbici primavera microdissezione. </li><li> Hai bisogno di due pinze a punta sottile. </li></ol> 3. Raccolta delle larve <ol><li> Vagando 3 ° larve instar che stanno esprimendo un tag vescicola proteina GFP sono raccolti su una piastra di Petri. </li><li> Le larve vengono lavati in acqua deionizzata per sbarazzarsi di tutto il cibo. </li></ol> 4. Dissezione dal vivo di larve <ol><li> Una larva è trasferito al cubo dissezione gel su un vetrino. Larva è immerso nel buffer dissezione. </li><li> Larva si struggeva al anteriore e posteriore con due perni bene con la parte dorsale fino. </li><li> Utilizzando le forbici microdissezione, un piccolo taglio viene effettuato presso la linea mediana verso la fine posteriore. Da questa incisione è fatta un taglio fino al anteriore. Utilizzando due pin, pin, la cuticola taglio sui bordi laterali. </li><li> Aggiungere una goccia di dissezione buffer. Rimuovere con attenzione l'intestino, intestino e organi di grasso con una pinza. La maggior parte di questi tessuti normalmente fuoriuscita durante il taglio dorsale. </li><li> Sostituire il buffer con fresca tampone dissezione. La larva non deve mai essere asciutto e deve essere costantemente in dissezione buffer. </li><li> Incubazioni utilizzando in vivo MitoTracker marcatori o LysoTracker sono fatte in questo momento, diluendo il marcatore in vivo nel buffer di dissezione. Dopo l'incubazione del marcatore in vivo lavare la larva sezionato diverse volte (5 lavaggi rapido) con ingredienti freschi buffer di dissezione. </li><li> Dopo aver sostituito l'ultimo lavaggio spingere i perni nel syligard e subito coprioggetto. Le larve è ora pronto per l'osservazione. </li></ol> 5. Immagini dal vivo di larve sezionato <ol><li> Posizionare il coprioggetto e gel sul palco microscopio e l'immagine utilizzando un microscopio invertito. </li><li> Noi usiamo una lente a 100x vescicole immagine tag all'interno larvale nervi segmentale. Espressione GFP nei corpi delle cellule del ganglio ventrale viene prima valutato prima di nervi segmentali sono ripreso. Se la colorazione GFP robusta è osservata nel corpo cellulare nel ganglio ventrale, i nervi sono poi fotografato e usato per la valutazione. </li><li> Utilizzando un sistema dual vista con filtri per CFP / YFP o RFP / YFP e visualizzare i software divisi possiamo simultaneamente immagine due proteine ​​tag in vivo. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1:. Un'immagine rappresentante che mostra molte vescicole assonale su molte piste assonale in un nervo larvale segmentale Notare le macchie di GFP, che rappresentano accumuli assonale. <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Una immagine rappresentativa che mostra una singola traccia assonale con molte vescicole assonale all'interno di un nervo larvale segmentale.

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144, 1075-1085 (1996).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In imaging in vivo di trasporto all&#39;interno delle vescicole sinaptiche Drosophila nervi larvale segmentale è un potente strumento per studiare i meccanismi di trasporto assonale. Abbiamo già utilizzato questo protocollo per valutare le dinamiche di trasporto all&#39;interno di nervi larvale esprimere ampliato ripete polyQ per chiarire come l&#39;espansione delle ripetizioni condizionare le dinamiche del trasporto delle vescicole 3. Utilizzando questo protocollo la velocità di mo...

<table><tbody><tr><td>1 paio di forbici da dissezione microchirurgiche</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Forbici a molla &amp;#8211; lama da 6 mm. Diametro della punta di 0,125 mm</td></tr><tr><td>2 paia di pinzette</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Pinzette da dissezione Fisherbrand Micro-Adson con punta seghettata</td></tr><tr><td>Scatola di spilli da dissezione</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Spilli Minutien con diametro di 0,1 mm</td></tr></tbody></table>

nella visualizzazione in vivo delle vescicole sinaptiche in drosophila assoni larvali segmentale

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Chiarire i meccanismi di trasporto assonale ha dimostrato di essere molto importante nel determinare come i difetti nel trasporto a lunga distanza influenzare diverse malattie neurologiche. Difetti in questo processo essenziale può avere effetti negativi sul funzionamento dei neuroni e lo sviluppo. Abbiamo sviluppato un protocollo di dissezione che è stato progettato per esporre la<em&gt; Drosophila</em&gt; Nervi larvale segmentale per visualizzare trasporto assonale in tempo reale. Abbiamo adattato questo protocollo per l&#39;imaging dal vivo da quello pubblicato da Hurd e Saxton (1996) utilizzata per immunolocalizatin larvale di nervi segmentale. Dissezione attenta e condizioni di buffer corretta è fondamentale per massimizzare la durata della vita delle larve sezionato. Se correttamente eseguita, larve sezionato hanno dimostrato di trasporto robusta vescicole per 2-3 ore in condizioni fisiologiche. Usiamo il metodo UAS-GAL4<sup&gt; 1</sup&gt; Per esprimere la GFP-tagged APP o vescicole synaptotagmin all&#39;interno di un singolo assone o assoni molti larvale nervi segmentali utilizzando diversi neuronali GAL4 driver. Altri marcatori fluorescenti tag, per esempio mitocondri (MitoTracker) o lisosomi (LysoTracker), può essere applicato anche alle larve prima di visualizzarlo. GFP-vescicola movimento e il movimento delle particelle possono essere visualizzati contemporaneamente con lunghezze d&#39;onda separate.

Questo protocollo descrive la dissezione dal vivo di<em&gt; Drosophila</emLarve&gt; allo scopo di immagini del movimento di GFP vescicole tag assonale sulle piste microtubuli.

Nella visualizzazione in vivo delle vescicole sinaptiche In Drosophila assoni larvali segmentale

L'elucidazione dei meccanismi del trasporto assonale si è dimostrata di fondamentale importanza per determinare in che modo i difetti nel trasporto a lunga distanza influenzino diversi...

Per studiare se siano presenti difetti nel trasporto assonico a lunga distanza in malattie neurologiche come la malattia di Alzheimer o la malattia di Huntington. Il trasporto assonico di vescicole di trasporto viene visualizzato in larve esofagee vive. Qui la meraviglia.Terzo stadio larvale in cui larve che esprimono una proteina fisica marcata con GFP vengono dissezionate su un cubetto di gel, quindi trasferite al microscopio per l'acquisizione di immagini in vivo. Successivamente, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per seguire il trasporto delle vescicole sinaptiche all'interno dell'assone. Il principale vantaggio dell'utilizzo di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti consiste nella visualizzazione del movimento vivo e ininterrotto delle vescicole sinaptiche e degli assoni larvali.Prepararsi per la dissezione assicurandosi che i seguenti materiali e reagenti siano a portata di mano. Buffer per dissezione. Un cubo di Sill guard ritagliato di un pollice di larghezza, un pollice di lunghezza e un centimetro di altezza, posizionato su un vetrino.Puntine da dissezione extra corte. La parte inferiore appuntita delle puntine manum è la più adatta per la dissezione. La lunghezza corretta può essere ottenuta inserendo puntine più lunghe nel gel e tagliando la parte che sporge.Sarà inoltre necessaria una coppia di forbici a molla per microdissezione, affilate, e due paia di pinzette fini. Utilizzare una spatola metallica piccola per trasferire larve di terzo stadio in stadio di stella che esprimono una proteina SLE marcata con GFP in una piastra di Petri.Successivamente, applicare acqua deionizzata alle larve nella piastra di Petri per rimuovere tutto il cibo. Quindi, utilizzando pinzette, trasferirle su un cubo di gel per dissezione per eseguire la dissezione su organismo vivo. Utilizzare le pinzette per trasferire una larva sul cubo di gel per dissezione.Su un vetrino di vetro, aggiungere il buffer di dissezione al vetrino per immergerlo. Successivamente, fissare la larva alle estremità anteriore e posteriore con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Utilizzando forbici per microdissezione, effettuare un piccolo taglio lungo la linea mediana in prossimità dell'estremità posteriore.Da questa incisione, effettuare un altro taglio fino alla regione anteriore. Gli intestini e i corpi adiposi fuoriescono utilizzando due spilli. Fissare l'esoscheletro tagliato ai bordi laterali del cubo di sughero.Usare una pipetta per aggiungere una goccia di buffer per dissezione. Quindi, utilizzando pinzette, rimuovere con cura gli intestini e i corpi adiposi. Applicare un fazzoletto di carta kimwipe su un lato della larva per rimuovere il buffer, aggiungendo contemporaneamente buffer fresco per dissezione mediante pipetta.La lava non deve mai essere secca. Per etichettare le strutture mitocondriali o lisosomiali nella lava, sostituire il buffer di dissezione con buffer di dissezione contenente mito tracker o lyo tracker. Posizionare il cubo di dissezione in una camera quadrata umidificata e coprirlo con carta d'alluminio.Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione con il marcatore in vivo, aspirare ripetutamente il buffer di dissezione presente attorno alle larve e aggiungere altro buffer di dissezione mediante pipetta. Ripetere questo passaggio cinque volte per rimuovere qualsiasi marcatore residuo.Dopo aver sostituito l'ultimo lavaggio, inserire completamente i perni nel supporto S e posizionare immediatamente un coprioggetto per evitare il movimento della larva. La larva è ora pronta per l'osservazione al fine di eseguire l'immagine in tempo reale della larva dissezionata. Posizionare il campione sul portacampioni di un microscopio invertito per acquisire immagini di vescicole marcate.All'interno dei nervi segmentali larvali. Eseguire l'acquisizione delle immagini utilizzando un obiettivo da 100 volte. Se la colorazione GFP è intensa, si osserva nei corpi cellulari del ganglio ventrale e nei nervi segmentali mediante un sistema a doppia visione con filtri per C-F-P-Y-F-P o R-F-P-Y-F-P e un software di suddivisione dell'immagine; in questo modo due proteine marcate in vivo possono essere visualizzate contemporaneamente.In questa serie a intervalli temporali si osservano molte vescicole assonali su numerosi tratti assonali all'interno di un nervo segmentale larvale. Si noti che la GFP, che rappresenta accumuli assonali, evidenzia anche il movimento bidirezionale delle vescicole. Qui si osserva il movimento di vescicole assonali su un singolo tratto all'interno di un nervo segmentale larvale.Notare che il movimento bidirezionale di questi sles è in media di un micrometro al secondo. Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire una dissezione accurata per l'osservazione in vivo di vescicole marcate con GFP e assoni larvali gsof.

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