Iniezione di An. Gli embrioni stephensi per generare la malaria resistenti zanzare

Zanzare anofele stephensi sono vettori per la malaria che abitano l'India e tutta l'Asia. Questo video mostra la tecnica per l'esecuzione di microiniezioni di questa specie con transgeni che conferiscono resistenza alla malaria alla zanzara. Gran parte della metodologia ha dimostrato in questo video è applicabile alle tecniche di microiniezione di altre specie di zanzare.

Ogni 15 secondi, c'è un bambino che muore di malaria nel mondo, qui nel laboratorio di James, o che cerca di creare zanzare francesi che non possono trasportare le persone malariche. Il mio nome è TIUs. Sono qui alla Universal of California Irvine presso il Dipartimento di Biologia Molecolare e Biochimica nel laboratorio di Anthony James.

Oggi vi mostrerò come fare l'occhio transgenico e non quello di Stevens. E lo stiamo facendo per rendere refrattarie le zanzare della malaria in modo che non possano trasportare il parassita della malaria. Ora ho preparato una fiala con tampone isotonico dove le zanzare deporranno le uova.

Userò questo aspiratore per aspirare le zanzare e metterci dentro una fiala. Questa fiala va poi in un'incubatrice a 30 gradi Celsius e la lasceremo per circa un'ora in una tazza. Ora tireremo fuori gli aghi per microiniezione.

Si tratta di aghi in quarzo e dobbiamo usare una punta molto sottile. Pertanto, abbiamo bisogno di questi estrattori per aghi. Usiamo un estrattore di aghi da Suter instruments e anche gli aghi da sottile in SU instruments.

Quindi, ora tolgo le zanzare e metto queste uova nella capsula di Petri, dove ho una carta da filtro imbevuta di tampone isotonico che serve solo a mantenere gli embrioni bagnati durante il periodo dell'iniezione. La quantità di acqua sulla carta da filtro è fondamentale. Non vuoi che le uova galleggino in giro e non vuoi che si secchino.

Ora sposterò l'embrione dalla carta dell'uovo su un'altra carta watman da tre MM che è stata imbevuta di tampone isotonico. Ora fai questo per rimuovere il Corian prima di allinearli per la microiniezione. Quindi ora tolgo il Corian, che è questa superficie argentea sulle uova.

E lo faccio spazzolandoli via con il mio pennello. Quindi, qui in cima, abbiamo un embrione in cui il Corian è ancora seduto e hanno questa parte argentea e lucente. Dov'è quello qui sotto?

Sono riuscito a togliere il Corian e questo probabilmente scivolerà su un nastro, mentre quello inferiore si attaccherà. E questo è ciò che è importante quando si fa un lato fuori pari. Ora sto allineando gli embrioni.

Gli embrioni sono più grandi all'estremità anteriore, e quello lo sto posizionando a destra. A sinistra ho l'estremità del poster, che è più sottile e che io, dove inietterò gli embrioni. Sto cercando di metterli insieme in modo che si aiutino a vicenda a rimanere in posizione.

E di solito ne faccio circa 10 in fila insieme. Ora ho una linea, gli embrioni, e li trasferirò su un vetrino di copertura. Sul vetrino di presentazione.

Ho messo del nastro adesivo per parrucche in modo che si attacchino. Quando ho finito, asciugherò la carta da filtro dove si trovano gli embrioni con un'altra carta da filtro, metterò gli embrioni sul vetrino coprioggetti e lo lascerò asciugare per 30 secondi prima di applicare l'olio. Ora abbiamo allineato gli embrioni e li abbiamo sotto l'olio.

Nella fase del microscopio, inietteremo il DNA mescolato con il colorante alimentare usando questa punta speciale del modello di microbo e inietteremo questo negli aghi della porta. Ora abbiamo riempito l'ago e lo abbiamo rimesso su un micro iniettore. E ora siamo pronti per fare le micro iniezioni.

Ora sto muovendo l'ago per affilarlo e io, così posso vederlo a fuoco. Una volta fatto ciò, sposto un ago del peso e mi sposto negli embrioni e metto a fuoco anche quelli. E quando questo è fatto, sposto di nuovo l'ago finché non lo ho in posizione e mi muovo sui miei embrioni.

Ora, quando l'ago passa attraverso l'olio, diventa sfocato ed è necessario regolarlo di nuovo. Quindi questo è esattamente lo squalo. Esatto, zecca squalo.

E ora sono pronto per fare le iniezioni. Si può vedere che ho toccato l'embrione con l'ago, e così facendo ho rotto la punta e si può vedere una piccola gocciolina che esce e che viene iniettata nell'embrione. Quindi qui inietta e tiralo fuori di nuovo.

E controllo ogni volta che tra un embrione e l'altro c'è una piccola gocciolina che esce dalla punta dell'ago. E come puoi vedere, ho bisogno di riadattarmi per ogni embrione per mettermi in posizione perfetta. Ora questo perdeva.

Come puoi vedere, quando faccio la mia seconda iniezione nell'olio, la bolla diventa molto grande e devo regolare nuovamente la pressione del micro iniettore. Quindi ora abbiamo finito con le micro iniezioni e sposteremo gli embrioni dal microscopio alla capsula di Petri, che abbiamo riempito con tampone isotonico. Toglierò l'olio dal vetrino coprioggetti e lo taglierò in un pezzettino, che metterò nella capsula di Petri.

Ora li lasceremo qui fino alla fine della giornata e a temperatura ambiente. E poi li spostiamo verso il basso nell'insettoriale. Oggi vi ho mostrato come iniettare un lato terribilmente Steven per fare zanzare transitorie.

E ora non ci resta che aspettare che le larve si schiudano, tutte le larve si schiudano. Porteremo fino agli adulti e poi si accoppieranno. E dopo di che avremo tre settimane prima di poter avviare una schermata, indipendentemente dal fatto che siano Refactoring o meno.