Name: Iniezione di An. Gli embrioni stephensi per generare la malaria resistenti zanzare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Impara la microiniezione di embrioni di Anopheles stephensi per generare zanzare transgeniche resistenti alla malaria. Questa tecnica permette di modificare geneticamente i vettori e ridurre la trasmissione della malattia.

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Preparazione in anticipo di microiniezione: <ol><li> Zanzare alimentazione del sangue: per iniezione da Lunedi a alimentare femmine Mercoledì sul precedente Venerdì. Per iniettare Giovedi e Venerdì, le femmine si nutrono di Lunedi della stessa settimana. </li><li> Preparare gli aghi quarzo utilizzando il programma 2 e tampone isotonica (vedi Materiali). </li><li> &quot;Posa tubo&quot; per gli embrioni è la regolare fiala cultura Drosophila. Cotone idrofilo bagnato in fondo, con un disco di carta da filtro umida che lo ricopre. </li><li> Preparare antiscivolo in plastica di copertura da attaccare a doppio lato del nastro ad una estremità. Tagliare il nastro per coprire scivolare in modo che termina al bordo del vetrino. </li><li> Preparare l&#39;olio per essiccamento. </li><li> Preparare una capsula di Petri con tampone isotonica di trasferire embrioni per la cova. </li></ol> Messa a punto di posa forzata: <ol><li> Raccogliere 6-10 sangue femmine alimentate con l&#39;uso di un aspiratore e di trasferirli al flaconcino cultura Drosophila con cotone e carta da filtro bagnata con tampone isotonica. </li><li> Le zanzare vengono poi rimessi in condizioni insectery al buio e ha permesso di deporre le uova per 1 ora e 15 min. </li><li> Lasciate che gli adulti volare nella gabbia e rimuovere il disco filtro di carta con gli embrioni. </li><li> Per allineare le uova, lo fanno nell&#39;ambito di applicazione dissezione. Raccogliere grappoli di uova con un pennello fine (Sable, n. 0000) e trasferimento in una piazza preparato di carta Whatman 3MM imbevuto di tampone isotonica. Tenere la carta sempre bagnato. Non lasciate che le uova si essiccato. Rimuovere il exochorion con il pennello, aiuta a bastone meglio le uova al nastro. </li><li> Utilizzando bene pinza n. 5 o un pennello fine, raccogliere gli embrioni grigio scuro e dispongono in linea sui quadrati di Whatman 3MM bagnato con tampone isotonica. Allineare 20-30 embrioni. Tutti gli embrioni devono essere nello stesso orientamento come l&#39;iniezione deve essere al polo posteriore. L&#39;estremità anteriore degli embrioni è leggermente più larga della posteriore. Poi, usando strisce di carta Whatman 3MM, asciugare il filtro in cui sono allineate le uova premendo duro su entrambi i lati della linea di uovo, non toccare le uova. </li><li> Per trasferire le uova, invertire la diapositiva che contiene il nastro biadesivo (Medicina), e premere delicatamente contro le uova. L&#39;estremità posteriore delle uova devono essere molto vicino al bordo del nastro biadesivo. L&#39;umidità della carta è fondamentale per questo, se è troppo bagnato che non si attacchi. Faccio essiccazione degli embrioni dal secondo 5-10, ma il tempo di essiccazione dipende dalla umido e la temperatura in camera microiniezione. </li><li> Essiccazione è di fondamentale importanza per le uova: po &#39;troppo e gli embrioni non si schiuderà. Senza DNA essiccazione non sta andando in embrione. </li><li> Coprire embrioni essiccati con olio Halocarbon per prevenire l&#39;essiccamento ulteriormente. </li></ol> Microiniezione degli embrioni: L&#39;aspetto più importante di iniezione buona è la qualità dell&#39;ago (vedi nota). <ol><li> Riempire un ago con la soluzione di DNA da iniettare utilizzando un microloader (Eppendorf # 5242 956,003). Molto poco soliution iniezione è necessaria, da 1 a 2 ml. </li><li> Collegare l&#39;ago al Transjector Eppendorf, che controlla il tempo di iniezione e la pressione, così come la contropressione. Microiniezione viene eseguita utilizzando un microscopio con un palco in movimento (Leica) in x 10 ingrandimenti e micromanipolatore (Leica). Se necessario, una fase microscopio sollevato può essere preparata impilando vetrini da microscopio 4-5. Posizionare il vetrino porta la embrioni sul palco rialzato. Gli embrioni vengono iniettati con un angolo di 150 °; penetrazione dovrebbe essere al polo posteriore. Per l&#39;iniezione, tengo l&#39;ago fermo e spostare lo stadio del microscopio. Quando l&#39;ago è nuovo, la punta è sigillato e si rompe di solito la prima iniezione. Ho sempre lavorato la pressione necessaria per espellere una piccola goccia di DNA in olio fra ogni iniezione. </li><li> Ho impostato il tempo di iniezione di 0,2-0,9 sec e 1000 hPa quando l&#39;ago è nuovo. Ho variare la pressione e tempo fino una piccola goccia si vede che esce dal l&#39;ago nel petrolio. La contropressione deve essere impostato circa 100. Come la punta dell&#39;ago viene consumato, la pressione di iniezione deve essere ridotta per mantenere il basso volume di iniezione (circa 300 hPa). Dopo questo, la punta dell&#39;ago è troppo grande e sta uccidendo la maggior parte delle embrioni. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, togliete l&#39;olio con carta velina e coprire il vetrino con embrioni e posto nella scatola di Petri con tampone isotonica. Porre le capsule nella insectory e lasciarli lì fino a quando gli embrioni portello. Cominciano a schiudono dopo 2-6 giorni. Trasferire le larve di acqua distillata con il pizzico di cibo a terra di pesce. </li></ol> Note DNA per iniezione: soluzione di DNA plasmidi iniettabile è stato isolato utilizzando EndoFree kit plasmide.Costruire plasmide e mescolare Helper plasmide insieme in giusta concentrazione, precipitato con isopropanolo. Il pellet è stato lavato con etanolo al 70% prima di risospendere nel buffer di iniezione. Prima dell&#39;iniezione, il DNA pulito utilizzando Millex-GV colonna. Tampone Izotonic: <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 1,68 M NaCl - 88,3 ml 1,68 M NaCl - 2,9 m 1 M Hepes -10,7 ml 1,12 M CaCl 2-2,2 ml dH 2 O - 896 ml </td><td> O </td><td> 5 M NaCl - 29,67 ml 1 M KCl - 4,87 ml 1 Hepes M - 10,7 ml 1,12 M CaCl 2-2,2 ml dH 2 O - 952,56 ml </td></tr></tbody></table> Aggiustare a pH 7,2

<table><tbody><tr><td>Aghi in quarzo per iniezione</td><td></td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Preparati con diametro esterno di 1,0 mm, diametro interno di 0,70 mm e lunghezza di 10 cm, tirando un capillare fino a ottenere una punta fine di 3-8 µm e un gambo di circa 100-300 mm mediante un micropipettatore.</td></tr><tr><td>Trattore per capillari in quarzo</td><td>Strumento</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000</td><td>Impostazioni: Calore-275, Fil-3, Vel-38, Rit-250, Trazione-141</td></tr><tr><td>Kit per plasmidi EndoFree</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonna Millex-GV</td><td></td><td></td><td>SLGV RO4 NL</td><td>per la purificazione del DNA</td></tr><tr><td>Costrutto di DNA</td><td></td><td></td><td></td><td>0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Plasmide helper</td><td></td><td></td><td></td><td>0,3 mg/ml</td></tr><tr><td>Soluzione di iniezione</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td>Soluzione 1x: 5 mM KCl, 0,1 mM fosfato di sodio, pH 6,8</td></tr><tr><td>Tampone isotonico</td><td></td><td></td><td></td><td>vedere la ricetta nella sezione del protocollo</td></tr><tr><td>Olio per disidratazione</td><td></td><td></td><td></td><td>Olio Halocarbon 700 : olio Halocarbon 27 (1:1). Mescolare bene. Preparare in anticipo rispetto alla microiniezione.</td></tr><tr><td>Sangue</td><td></td><td></td><td></td><td>per nutrire le zanzare</td></tr><tr><td>Anopheles stephensi</td><td>Animale</td><td></td><td></td><td>Zanzare, maschi e femmine.</td></tr><tr><td>Fiala per coltura di Drosophila</td><td></td><td></td><td></td><td>per la deposizione delle uova</td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td></td><td></td><td></td><td>con tampone isotonico, per l’eclosione degli embrioni</td></tr><tr><td>Pennello fine</td><td></td><td></td><td></td><td>Sable n. 0000</td></tr><tr><td>Carta Whatman 3MM</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette n. 5</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nastro adesivo doppia faccia</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microloader</td><td></td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Transjector</td><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>con piatto mobile e micromanipolatore, impostato a un ingrandimento di 10x</td></tr></tbody></table>

iniezione di an. gli embrioni stephensi per generare la malaria resistenti zanzare

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

L&#39;introduzione di geni esogeni nel genoma delle zanzare richiede tecniche di microiniezione su misura per le specie di interesse specifico. Questo protocollo video dimostra un metodo utilizzato dal laboratorio di James a microinject costrutti di DNA in embrioni Anopheles stephensi per la generazione di zanzare trasformato. Tecniche di preparazione aghi microiniezione, la raccolta e la preparazione degli embrioni e l&#39;esecuzione della microiniezione sono illustrati.

Zanzare anofele stephensi sono vettori per la malaria che abitano l&#39;India e tutta l&#39;Asia. Questo video mostra la tecnica per l&#39;esecuzione di microiniezioni di questa specie con transgeni che conferiscono resistenza alla malaria alla zanzara. Gran parte della metodologia ha dimostrato in questo video è applicabile alle tecniche di microiniezione di altre specie di zanzare.

Iniezione di An. Gli embrioni stephensi per generare la malaria resistenti zanzare

L'introduzione di geni esogeni nei genomi delle zanzare richiede tecniche di microiniezione calibrate sulla specifica specie di interesse. Questo...

Ogni 15 secondi, nel mondo muore un bambino a causa della malaria; qui nel laboratorio di James stiamo cercando di creare zanzare francesi che non possano trasmettere il parassita della malaria. Mi chiamo TIUs. Sono qui all'Università della California, Irvine, presso il Dipartimento di Biologia Molecolare e Biochimica, nel laboratorio di Anthony James.Oggi vi mostrerò come produrre occhi transgenici e non di Stevens. Eseguiamo questo procedimento per rendere le zanzare resistenti alla malaria, in modo che non possano trasmettere il parassita della malaria. Ho preparato un flacone con una soluzione tamponata isotonica in cui le zanzare depositeranno le uova.Utilizzerò questo aspiratore per raccogliere le zanzare e metterle in un vial. Questo vial verrà quindi inserito in un incubatore a 30 gradi Celsius, dove lo lasceremo per circa un'ora in un bicchiere. Ora prepareremo gli aghi per microiniezione.Questi sono aghi realizzati in quarzo e dobbiamo utilizzare una punta molto fine. Pertanto, abbiamo bisogno di questo estrattore per aghi. Utilizziamo un estrattore per aghi della Suter Instruments e anche gli aghi della Subtle in SU Instruments.Ora estraggo le zanzare e depositerò queste

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Reverse approcci genetici si sono dimostrati estremamente utili per determinare quali geni di resistenza agli agenti patogeni sottostanti vettore nelle zanzare. Questo protocollo video illustra un metodo utilizzato dal laboratorio di James per iniettare dsRNA in femmine di A. aegypti zanzare, che ospitano il virus dengue. La tecnica per la calibrazione di aghi da iniezione, manipolare la configurazione di iniezione e iniezione di dsRNA nel torace è illustrato.

Iniezione di dsRNA in femmine di A. aegypti Zanzare

In questo video, Nijole Jasinskiene dimostra la metodologia utilizzata per generare transgenici zanzare Aedes aegypti, che sono vettori per la febbre dengue. Le tecniche per la corretta preparazione di aghi microiniezione, disidratanti embrioni, e l'esecuzione di microiniezione sono dimostrati.

Microiniezione di A. aegypti embrioni per ottenere zanzare transgeniche

In questa intervista, George Dimopoulos si concentra sui meccanismi fisiologici utilizzato dalle zanzare per combattere Plasmodium falciparum e infezioni da virus dengue. Spiegazione è data per come i geni chiave refrattari, quei geni che conferiscono resistenza agli agenti patogeni vettore, sono identificati nella zanzara e come questa conoscenza può essere utilizzata per generare le zanzare transgeniche che sono in grado di trasportare il parassita della malaria o il virus dengue.

Costruire un Mosquito migliore: l&#39;identificazione dei geni Abilitazione malaria e febbre dengue Resistenza in A. gambiae e A. aegypti zanzare

Incroci genetici di parassiti della malaria roditori vengono eseguite da mangiare due parassiti geneticamente distinte alle zanzare. Ricombinante progenie vengono clonati dal sangue del mouse dopo aver lasciato le zanzare a mordere topi infettati. Questo video mostra come produrre incroci genetici...

Protocollo per la produzione di un incrocio fra i roditori parassiti della malaria

In questo video, dimostriamo l'integrazione del transgene sito-specifico mediata da phiC31 nell'embrione di Anopheles tramite microiniezione. Questo metodo aiuta a introdurre i geni desiderati in un sistema ospite per la ricerca e le applicazioni industriali.

Integrazione transgenica sito-diretta mediata da phiC31-integrasi: una tecnica di microiniezione per l'integrazione di transgeni sito-specifici in un vettore di anofele

In questo video, dimostriamo la consegna del costrutto gene drive nell'embrione della zanzara Anopheles gambiae attraverso la tecnica della microiniezione embrionale. Questa procedura consente l'integrazione del costrutto di DNA consegnato, attraverso la ricombinazione omologa, nelle cellule germinali per generare una popolazione di zanzare trasformata.

Microiniezione di embrioni di zanzara: una tecnica per fornire DNA esogeno nel tuorlo embrionale di Anopheles gambiae per generare mutazioni germinali

CRISPR/Cas9 è sempre più utilizzato per caratterizzare la funzione genica in organismi non modello. Questo protocollo descrive come generare linee knock-out di Culex pipiens, dalla preparazione di miscele di iniezione, all'ottenimento e all'iniezione di embrioni di zanzara, nonché come allevare, incrociare e schermare le zanzare iniettate e la loro progenie per le mutazioni desiderate.

Preparazione e iniezione di embrioni di zanzare Culex per generare mutazioni nulle utilizzando CRISPR / Cas9

Il protocollo descrive come ottenere modifiche dirette al sito nel genoma delle zanzare Anopheles malaria utilizzando il sistema φC31 . Le modifiche descritte includono sia l'integrazione che lo scambio di cassette transgeniche nel genoma di linee di attP..

Integrazione mediata dal sito φC31 e scambio di cassette in Anopheles Vettori della malaria

Le tecniche di microiniezione sono essenziali per introdurre geni esogeni nei genomi delle zanzare. Questo protocollo spiega un metodo utilizzato dal laboratorio James per microiniettare costrutti di DNA in embrioni di Anopheles gambiae per generare zanzare trasformate.

Metodo di microiniezione per embrioni di Anopheles gambiae

La malaria si trasmette attraverso l'inoculazione dello stadio sporozoite di Plasmodium da parte di zanzare infette. Il Plasmodium transgenico ci ha permesso di comprendere meglio la biologia della malaria e ha contribuito direttamente agli sforzi di sviluppo del vaccino contro la malaria. In questo articolo descriviamo una metodologia semplificata per generare sporozoiti transgenici di Plasmodium berghei .

Generazione di sporozoiti geneticamente modificati di Plasmodium berghei

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'editing del genoma attraverso la microiniezione embrionale nella zanzara A. aegypti utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9.

Editing del genoma nella zanzara della febbre gialla Aedes aegypti utilizzando CRISPR-Cas9

Impara la microiniezione di embrioni di Anopheles stephensi per generare zanzare transgeniche resistenti alla malaria. Questa tecnica permette di modificare geneticamente i vettori e ridurre la trasmissione della malattia.

Iniezione di An. Gli embrioni stephensi per generare la malaria resistenti zanzare

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