Iniezione di An. Gli embrioni stephensi per generare la malaria resistenti zanzare

Ogni 15 secondi, nel mondo muore un bambino a causa della malaria; qui nel laboratorio di James stiamo cercando di creare zanzare francesi che non possano trasmettere il parassita della malaria. Mi chiamo TIUs. Sono qui all'Università della California, Irvine, presso il Dipartimento di Biologia Molecolare e Biochimica, nel laboratorio di Anthony James.

Oggi vi mostrerò come produrre occhi transgenici e non di Stevens. Eseguiamo questo procedimento per rendere le zanzare resistenti alla malaria, in modo che non possano trasmettere il parassita della malaria. Ho preparato un flacone con una soluzione tamponata isotonica in cui le zanzare depositeranno le uova.

Utilizzerò questo aspiratore per raccogliere le zanzare e metterle in un vial. Questo vial verrà quindi inserito in un incubatore a 30 gradi Celsius, dove lo lasceremo per circa un'ora in un bicchiere. Ora prepareremo gli aghi per microiniezione.

Questi sono aghi realizzati in quarzo e dobbiamo utilizzare una punta molto fine. Pertanto, abbiamo bisogno di questo estrattore per aghi. Utilizziamo un estrattore per aghi della Suter Instruments e anche gli aghi della Subtle in SU Instruments.

Ora estraggo le zanzare e depositerò queste uova in una piastra di Petri contenente una carta da filtro imbevuta di tampone isotonico, che serve a mantenere gli embrioni umidi durante il periodo di iniezione. La quantità di acqua sulla carta da filtro è fondamentale: non si devono far galleggiare le uova, ma non si deve permettere neppure che si asciughi.

Ora sposterò l'embrione dal foglio di carta per uova su un altro foglio di carta Watman da tre mm che è stato inumidito con buffer isotonico. Questa operazione va eseguita per rimuovere la corion prima di allineare gli embrioni per la microiniezione. Ora rimuoverò il corion, che è la superficie argentata delle uova.

E lo faccio spazzolandoli via con il mio pennello. Quindi qui in alto abbiamo un embrione in cui il Corian è ancora presente e presenta questa parte argentata e lucente. Dov'è quello qui sotto?

Sono riuscito a rimuovere con successo il Corian e questo superiore probabilmente scivolerà su un nastro, mentre quello inferiore aderirà. Ed è ciò che è importante quando si esegue un montaggio su lati diseguali. Ora sto allineando gli embrioni.

Gli embrioni sono più grandi all'estremità anteriore, che posiziono a destra. A sinistra ho l'estremità posteriore, più sottile, dove inietterò gli embrioni. Cerco di disporli in modo che si sostengano a vicenda per mantenere la posizione.

Di solito ne preparo circa 10 in fila. Ora ho una fila di embrioni, che trasferirò su un'oggettino copri vetrino. Sull'oggettino copri vetrino.

Ho utilizzato del nastro adesivo per parrucche per farli aderire. Una volta terminato, asciugherò la carta da filtro su cui si trovano gli embrioni con un'altra carta da filtro, metterò gli embrioni sul vetrino coprioggetto e lascerò asciugare per 30 secondi prima di applicare l'olio. Ora abbiamo allineato gli embrioni e li abbiamo sotto l'olio.

Sul palcoscenico del microscopio, inietteremo il DNA mescolato con un colorante alimentare utilizzando questa punta speciale del modello microbico e inietteremo questo nel ago del porto. Ora abbiamo riempito l'ago e lo abbiamo rimesso su un microiniettore. E ora siamo pronti per eseguire le microiniezioni.

Ora muovo l'ago per affilarlo e poterlo vedere a fuoco. Una volta completato ciò, sposto l'ago del peso e introduco gli embrioni, mettendoli a fuoco anch'essi. E quando questo è fatto, riposiziono nuovamente l'ago finché non è nella posizione corretta e proseguo con i miei embrioni.

Ora, quando l'ago attraversa l'olio, l'immagine diventa sfocata e bisogna regolarla nuovamente. Quindi è esattamente squalo. Esattamente, zecca dello squalo.

Ora sono pronto per eseguire le iniezioni. Potete vedere che ho toccato l'embrione con l'ago e, facendolo, ne ho rotto la punta; ora si vede una piccola goccia che fuoriesce e che verrà iniettata nell'embrione. Dunque, qui si inietta e poi si ritira nuovamente.

E controllo ogni volta tra ogni embrione che fuoriesca una piccola goccia sulla punta dell'ago. E come potete vedere, devo riaggiustare la posizione per ogni embrione per ottenere un allineamento perfetto. Ora questo stava perdendo liquido.

Come si può vedere, quando eseguo la seconda iniezione nell'olio, la bolla diventa molto grande e devo riassestare la pressione della micropipetta. A questo punto abbiamo terminato le micropiniezioni e sposteremo gli embrioni dal microscopio alla piastra di Petri, che abbiamo riempito con tampone isotonico. Rimuoverò l'olio dalla lamella e la taglierò in un piccolo pezzo, che depositerò nella piastra di Petri.

Ora li lasceremo qui fino alla fine della giornata a temperatura ambiente. Successivamente li trasferiremo nell'insettaio. Oggi vi ho mostrato come iniettare un'ampolla di Steven per ottenere zanzare transitorie.

E ora dobbiamo solo aspettare che le larve schiudano, tutte quante. Le alleviamo fino allo stadio adulto e poi si accoppieranno. Dopodiché, dovremo attendere tre settimane prima di poter iniziare uno screening per verificare se sono Refactor o meno.