Name: Blu nativi poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) per lanalisi di complessi multiproteici da lisati cellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Impara la caratterizzazione di complessi multiproteici mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide blu nativo (BN-PAGE) da lisati cellulari. Questa tecnica bidimensionale preserva le interazioni proteiche native.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Michael Reth, Hermann Schägger, e Margherita Camacho-Carvajal al sostegno scientifico. Questo lavoro è stato finanziato dalla FORSYS dal Bundesministerium für Bildung e Forschung (BMBF), dal BIOS dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), e sostenuta in parte dal Iniziativa eccellenza dei governi tedesco e Stato (GSC-4, Spemann Graduate School ).

<ol><li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer%3A+identification+of+three+dimer-specific+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li>
<li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Blue+native%2FSDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates%3A+a+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li>
<li>Heiss, K., Junkes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subproteomic+analysis+of+metal-interacting+proteins+in+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells.</a> Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).</li>
<li>Sali, A., Glaeser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+words+to+literature+in+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422, 216-225 (2003).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li>
<li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li>
<li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li>
<li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+%28NAMOS-assay%29+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li>
<li>Swamy, M., Siegers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+the+identification+and+analysis+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes.</a> Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo studio, descriviamo l&#39;analisi di PPM da BN-PAGE. Un approccio 2D viene utilizzato al primo PPM separare in condizioni native, e poi ulteriormente suddividere nelle loro componenti singoli da una seconda dimensione SDS-PAGE. I campioni sono preparati con lisati cellulari. Per la solubilizzazione di PPM molti, un detergente appropriata è indispensabile, che conserva la struttura dei complessi proteici. Qui, usiamo 0,1% Triton X-100. Tuttavia, il detergente ottimale e la sua concentrazione adatta devono essere determinate empiricamente per ogni MPC. In caso di Triton X-100, per esempio, è stato riportato che le concentrazioni di detergenti a basso permettono l&#39;identificazione di una forma dimerica della F 1 F 0-ATPasi complesso (Arnold, Pfeiffer et al. 1998). Superiore Triton X-100 concentrazioni, tuttavia, portano alla dissociazione del dimero e ad un corrispondente aumento del monomerico F 1 F 0-ATPasi complesso. Ciò è in linea con uno dei nostri studi precedenti, sono stati dimostriamo che il polivalente cellule T complesso recettore (TCR) viene conservato quando estratto con basse concentrazioni di Brij 96, mentre l&#39;uso di una maggiore concentrazione o di un altro detergente chiamato digitonina risultati in l&#39;estrazione di monomerico TCR (Schamel, Arechaga et al. 2005). Detergenti comunemente usati che possono essere testati includono digitonina (da 0,5 a 1%), Triton X-100 (da 0,1 a 0,5%), Brij 96 (da 0,1 a 0,5%), o dodecylmaltoside (0,1 allo 0,5%). Questi reagenti sono detergenti non ionici, che tendono ad essere migliori per la stabilità MPC. Essere consapevoli del fatto che il contatto con SDS e altri detergenti aggressivi deve essere evitato (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Dialisi del lisati è necessario per realizzare la separazione MPC in una BN-gel (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004.), (Heiss, Junkes et al 2005).. Sembra che la regolazione della concentrazione di sale o la rimozione delle impurità a basso peso molecolare è di fondamentale importanza per alta risoluzione. È interessante notare che anche le preparazioni di membrana e PPM, che sono stati immunopurified e poi eluito dalla anticorpi, sono adatti per BN-PAGE (Swamy, Siegers et al. 2006). In entrambi i casi, i campioni non devono essere dializzati per BN-PAGE la separazione, se lisi membrana o eluizione viene effettuata in BN-lisi buffer. Per la separazione delle proteine ​​da BN-PAGE, il colorante Coomassie blu è necessario, che si lega alle proteine ​​unspecifically e li copre con cariche negative. In tal modo, Coomassie blu consente la mobilità elettroforetica delle proteine ​​verso il catodo a pH neutro (Schägger e von Jagow 1991); (Schägger, Cramer et al 1994).. Inoltre, Coomassie blu impedisce l&#39;aggregazione delle proteine ​​nel gel di impilamento durante l&#39;elettroforesi. Per BN-PAGE, Coomassie G250 deve essere usato al posto di Coomassie R250 blu o blu Coomassie colloidale. Prima di eseguire una BN-gel, è necessario garantire che la percentuale di gel si adatta alla dimensione prevista del MPC di interesse. Prefabbricati BN-gel con pendenze diverse e tamponi adatti sono disponibili in commercio da Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System). Ma BN-gel può anche essere preparata usando un gradiente mixer insieme con una pompa persistaltic. Per garantire un gradiente intatto, il liquido deve fluire costantemente durante il getto e le bolle dovrebbero essere evitati. Si consiglia il caricamento di diverse diluizioni del campione sul gel perché sovraccarico può portare alla precipitazione delle proteine ​​durante il processo di elettroforesi. Inoltre, BN-gel dovrebbe essere eseguito a 4 ° C per evitare la degradazione delle proteine ​​e di mantenere intatto il PPM. Dopo BN-PAGE, la visualizzazione di MPC può essere raggiunto con la colorazione Coomassie blu brillante, colorazione argento o immunoblotting. Bande proteiche visualizzate mediante colorazione Coomassie o argento sono adatti per ulteriori analisi mediante spettrometria di massa (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). In caso di immunoblotting, le condizioni di trasferimento ottimale per i PPM di interesse devono essere determinati empiricamente. Essere consapevoli del fatto che Coomassie blu è anche trasferito durante assorbente di una BN-gel. Pertanto, il gel sarà incolore dopo il trasferimento di successo, mentre la membrana in grado di esercitare un colore blu. Inoltre, è importante ricordare che non tutti gli anticorpi primari, che lavora per il rilevamento dopo SDS-PAGE, è applicabile a immunoblotting su BN-PAGE. Può succedere che gli anticorpi non riconoscono il MPC di interesse perché la loro epitopo è nascosto nella conformazione nativa delle proteine. Per superare questo problema, è possibile denaturare le proteine ​​all&#39;interno della BN-gel prima del trasferimento facendo bollire il gel a breve nella tampone 1x campione SDS. Nel nostro esempio, noi non sottoporre il BN-gel direttamente al rilevamento di bande proteiche. Invece, abbiamo ulteriormente diviso il BN-PAGE-lisato separati da un secondo dimensisu SDS-PAGE. Nella seconda dimensione SDS-gel, proteine ​​monomeriche migrare all&#39;interno di un diagonale iperbolica a causa del gradiente di gel nel primo e il gel lineare nella seconda dimensione (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Questo permette la facile identificazione dei PPM, dal momento che sono localizzati sotto questa diagonale iperbolica. Sottocomponenti di un distinto MPC sono separati in una linea verticale nella seconda dimensione SDS-PAGE. I componenti che rientrano nella composizione di PPM dinstinct diverse possono essere identificati su una linea orizzontale a seconda delle dimensioni del MPC. Tuttavia, è da considerare che gli spot di proteine ​​diverse che appare in una linea verticale potrebbe anche far parte di complessi separati che migrano nella stessa posizione in BN-PAGE. La prova finale che sono presenti nello stesso MPC può essere ottenuta con un anticorpo saggio basato su gel shift. In questo saggio, lisato cellulare viene incubato con un anticorpo contro una proteina rappresentata da uno dei luoghi individuati prima BN-PAGE. Ciò si traduce in uno spostamento di tutti i PPM che contengono questa proteina verso una massa molecolare maggiore nella prima dimensione. Altre proteine ​​che sono anche una parte di questi PPM subirà questo complesso specifico turno e sono quindi facili da identificare nella seconda dimensione SDS-gel. Non solo la composizione del MPC può essere analizzato BN-PAGE, ma anche la determinazione della loro stechiometria è possibile (e Schamel Reth 2000); (Schamel 2001), (Swamy, Minguet et al 2007).. A tal fine, un test Namos (nativo a base di anticorpi mobilità-shift test) può essere eseguita. Come nel anticorpi saggio basato su gel di turno, il lisati cellulari vengono incubati con subunità monoclonali specifici anticorpi. Questo porta a l&#39;induzione di immunoshifts elettroforetici nel BN-gel, che consentono l&#39;inferenza dalla misura dello spostamento sulla stechiometria di PPM In conlusion, BN-PAGE è adatto per l&#39;identificazione di PPM e la determinazione della loro dimensione, composizione, così come l&#39;abbondanza relativa. Eseguito come un test Namos, offre anche la possibilità di determinare la stechiometria di un certo MPC. Data la sua applicabilità generale, questa tecnica è uno strumento molto utile per la caratterizzazione di PPM (Dekker, Müller et al 1996.) (Wittig e Schagger 2008); (Wagner, Rehling et al 2009.) (Wittig e Schägger 2009) .

blu nativi poliacrilammide gel elettroforesi (bn-page) per l&#39;analisi di complessi multiproteici da lisati cellulari

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Complessi multiproteici (PPM) svolgono un ruolo cruciale nella segnalazione cellulare, poiché la maggior parte delle proteine ​​si trovano in complessi funzionali o di regolamentazione con altre proteine ​​(Sali, Glaeser et al. 2003). Così, lo studio della proteina-proteina reti di interazione richiede la caratterizzazione dettagliata dei PPM di acquisire una comprensione integrativa della funzione della proteina e della regolamentazione. Per l&#39;identificazione e l&#39;analisi, MPC deve essere separata in condizioni native. In questo video, si descrive l&#39;analisi di PPM di blu elettroforesi nativa su gel di poliacrilamide (BN-PAGE). BN-PAGE è una tecnica che permette la separazione di PPM in una conformazione nativa con una risoluzione superiore a quella offerta da gel filtrazione o la densità ultracentrifugazione saccarosio, ed è quindi utile per determinare la dimensione del MPC, la composizione e l&#39;abbondanza relativa (Schägger e von Jagow 1991) ; (Schägger, Cramer et al 1994).. Con questo metodo, le proteine ​​sono separate in base alle loro dimensioni e la forma idrodinamica in una matrice di poliacrilamide. Qui, dimostriamo l&#39;analisi di PPM del totale lisati cellulari, sottolineando che la dialisi lisato è il passo fondamentale per rendere BN-PAGE applicabili a questi campioni biologici. Usando una combinazione di prima dimensione BN-e seconda dimensione SDS-PAGE, dimostriamo che PPM separati da BN-PAGE può essere ulteriormente suddivisa in loro singoli costituenti mediante SDS-PAGE. Visualizzazione dei componenti MPC su gel di separazione viene effettuata mediante immunoblotting standard. Come esempio di analisi da MPC BN-PAGE, abbiamo scelto la 19S ben caratterizzati eucariotiche, 20S, 26S e proteasomi.

In questo video, si descrive la caratterizzazione di complessi multiproteici (PPM) di blu elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo (BN-PAGE). In una prima dimensione, dializzati lisati cellulari sono separati da BN-PAGE per identificare i singoli PPM. In una seconda dimensione SDS-PAGE, PPM di interesse sono ulteriormente suddivisi per analizzare i loro elettori mediante immunoblotting.

Blu nativi poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) per l&#39;analisi di complessi multiproteici da lisati cellulari

I complessi multiproteici (MPC) svolgono un ruolo cruciale nella segnalazione cellulare, poiché la maggior parte delle proteine si trova in complessi funzionali o regolatori con altre...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è caratterizzare un complesso MultiPro da lisati cellulari utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide nativa blu, che, a differenza della SDS-PAGE, consente la separazione delle proteine in condizioni native preservando le interazioni proteina-proteina. Questo risultato si ottiene dializzando il lisato cellulare per rimuovere i sali in eccesso, rendendo il campione idoneo alla separazione mediante PAGE nativa blu come secondo passaggio. Il lisato viene applicato alla PAGE nativa blu in prima dimensione, che separa i complessi proteici in condizioni native in base alle loro dimensioni e forma.Successivamente, una seconda dimensione. Viene eseguita un'elettroforesi SDS-PAGE denaturante al fine di suddividere i complessi nei loro singoli costituenti. Le proteine possono essere visualizzate mediante colorazione con argento o con Coomassie oppure tramite western blotting.In questa dimostrazione, le proteine separate sono state rilevate mediante colorazione argentica; tuttavia, verrà utilizzato il western blotting. Ciao, sono Brita Bloom del laboratorio di Wolfgang Sharmel del Dipartimento di Immunologia Molecolare presso l'Istituto Max Planck di Immunobiologia a Friburgo, Germania. Ciao, sono Dina Fiala.Sono anch'io del laboratorio Sham. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'analisi di complessi MultiPro da lisati cellulari. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare la composizione di recettori di membrana con molteplici subunità.Tuttavia, in questo video utilizzeremo il proteasoma tic come esempio. Cominciamo. Prima di iniziare questa procedura, preparare tutti i tamponi come descritto nel protocollo scritto e mantenerli a quattro gradi Celsius.Raccogliere 10 milioni di cellule HEC 2 9 3 e formare un pellet mediante centrifugazione a 350 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi lavare il pellet cellulare con un millilitro di PBS freddo di ghiaccio ed eseguire una centrifugazione per raccogliere le cellule lavate. Ripetere questo lavaggio due volte, quindi risospendere il pellet cellulare lavato in 250 microlitri di ghiaccio.Blando blu freddo, lisare in tampone nativo e incubare la sospensione sul ghiaccio per 15 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule vive a 13.000 ×g per 15 minuti a 4 °C per rimuovere il materiale insolubile. Nel frattempo, fondere un foro nel tappo di un tubo da microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando la parte di diametro maggiore riscaldata di una pipetta per pasta.Quindi posizionare il tubo sul ghiaccio per raffreddarlo fino a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, trasferire il lisato nel tubo destinato alla rimozione del sale mediante dialisi. Posizionare una membrana dialitica con cutoff di 10 kilodalton sulla parte superiore del tubo aperto.Chiudere il cappuccio e tagliare qualsiasi eccesso di membrana per dialisi che sporge. Quindi sigillare con cura il lato del cappuccio con del param; una volta sigillato, capovolgere il tubo e posizionarlo a testa in giù in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare il campione alla velocità più bassa possibile per 10 secondi.In una centrifuga per colture cellulari, preparare un becher da 100 millilitri con tampone freddo per dialisi in condizioni native blu e un agitatore magnetico utilizzando almeno 10 millilitri di tampone per dialisi in condizioni native blu ogni 100 microlitri di campione. Successivamente, rimuovere il tubo capovolto dal tubo conico utilizzando pinzette. Per evitare di rimettere il tubo nella posizione normale.Appoggia il tubo con il nastro adesivo capovolto all'interno del becher ed elimina eventuali bolle d'aria dal foro sotto il tappo. Utilizzando una pipetta Pasteur piegata, accendi l'agitatore magnetico e lascia il campione per sei ore o durante la notte in frigorifero per effettuare la dialisi. Controlla occasionalmente il campione per assicurarti che l'agitazione non stia generando bolle d'aria sulla membrana di dialisi.Dopo l'incubazione, trasferire il lisato cellulare dializzato in un nuovo tubo microcentrifuga pre-raffreddato e mantenerlo sul ghiaccio fino al caricamento sul gradiente del gel. La preparazione del gel avviene a temperatura ambiente utilizzando un mescolatore per gradienti. Posizionare il mescolatore per gradienti su una piastra magnetica e collegarlo a un pezzo di tubo flessibile.Chiudere il canale del miscelatore a gradiente utilizzando la valvola e chiudere il tubo con una pinza. Inserire un agitatore magnetico nel cilindro collegato al tubo. Successivamente, inserire il tubo flessibile in una pompa peristaltica e collegare un ago da siringa alla sua estremità.Quindi posizionare l'ago tra le due piastre di vetro nella parte superiore dell'apparato elettroforetico. Preparare soluzioni di gel separante al 4% e al 15% in modo che i volumi combinati siano pari al volume del gel separante. Aggiungere immediatamente un PS e TM poco prima.Utilizzare e versare le soluzioni di gel nei cilindri corrispondenti del miscelatore a gradiente. Quindi accendere l'apparecchio e aprire la valvola. Premere sul cilindro sinistro per espellere la bolla d'aria presente nel canale che collega i due serbatoi del gel.Accendere la pompa a cinque millilitri al minuto. Rimuovere la pinza e lasciare scorrere lentamente il gel tra le lastre di vetro. Alzare lentamente l'ago quando il gel si ferma, assicurandosi che l'ago sia sempre al di sopra del liquido.Fare in modo che tutto il liquido entri nell'apparato per gel. Quindi sovrapporre delicatamente il liquido con isopropanolo e risciacquare l'apparato con acqua distillata. Lasciare polimerizzare il gel per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.Successivamente, preparare un gel di raccolta al 3,2%, aggiungendo PS e TM subito prima dell'uso. Versare il gel di raccolta sopra il gel di separazione e inserire il pettine tra le lastre di vetro, evitando bolle d'aria. Dopo la polimerizzazione del gel di raccolta, raffreddare immediatamente il gel a quattro gradi Celsius prima del caricamento del campione.Rimuovere il pettine lentamente, estraendolo con un angolo rispetto al piano del gel. Questo permette all'aria di entrare rapidamente nelle tasche, migliorando la qualità dei pozzetti per separare il lisato cellulare dializzato mediante blue native page: caricare 20 microlitri del marcatore ferritina e 40 microlitri del lisato dializzato nei pozzetti asciutti. A quattro gradi Celsius, i pozzetti vuoti vengono riempiti con volumi uguali di buffer di dialisi. Successivamente, sovrapporre i campioni in ciascun pozzetto con buffer catodico freddo.Riempire la camera interna con tampone catodico freddo e la camera esterna con tampone anodico freddo. Lavorare a quattro gradi Celsius e applicare 100 volt finché i campioni non sono entrati nel gel di separazione. Aumentare quindi la tensione a 180 volt ed eseguire l'elettroforesi finché il fronte colorato non raggiunge l'estremità del gel.L'esecuzione richiede da tre a quattro ore. Per la corsa SDS-PAGE in seconda dimensione, preparare un gel standard al 10% SDS con una singola corsia larga. Una corsia per il marcatore del peso molecolare e una corsia per un'aliquote del controllo del lisato dializzato che è stata mescolata con il buffer campione SDS e bollita per cinque minuti a 95 gradi Celsius; rimuovere il gel BN-PAGE dalle lastre dall'apparato di elettroforesi e sollevare delicatamente una delle lastre.Rimuovere il gel di stacking e ritagliare la corsia del gel BN-PAGE contenente le proteine di interesse. Posizionare il frammento di gel BN-PAGE nel buffer campione SDS e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente su un agitatore. Successivamente all'incubazione, far bollire brevemente il frammento di gel in un forno a microonde, quindi incubare per altri 15 minuti.Nel buffer campione SDS su un agitatore, rimuovere la pettina del gel SDS e riempire con del buffer SDS il pozzetto, quindi caricare la fetta di gel blue native page nel pozzetto grande del gel SDS. Evitare bolle d'aria. Potrebbe essere utile utilizzare una pinzetta per agevolare l'operazione, poiché la fetta di gel deve essere posizionata esattamente sul gel di stacking.Coprire il trancio con tampone campione SDS, quindi caricare il marcatore e il controllo del lisato. Eseguire l'elettroforesi e il trasferimento delle proteine secondo protocolli standard. Per interpretare i risultati, è importante sapere che la posizione di una proteina nella seconda dimensione della gel elettroforesi blue native SDS fornisce indicazioni sull'appartenenza della proteina a un complesso MultiPro o meno.Le proteine monomeriche migrano lungo una diagonale iperbolica a causa del gel a gradiente nella prima dimensione e come un gel lineare nella seconda dimensione; i sottounità dei complessi MultiPro si trovano al di sotto della diagonale, formando una linea verticale. Se una determinata proteina fa parte di complessi distinti, vengono rilevati diversi spot disposti in una linea orizzontale. In sintesi, l'approccio bidimensionale blue native PAGE SDS-PAGE permette di determinare la composizione, le dimensioni e l'abbondanza relativa dei complessi MultiPro.In questa dimostrazione, diversi proteasomi o subunità sono stati rilevati mediante blotting western. Le subunità beta due e MCP 21 potevano essere rilevate come punti individuali disposti verticalmente, indicando che fanno parte degli stessi complessi. PA 28 si trova in un'unica linea verticale con beta due e CP 21 e quindi appartiene allo stesso complesso.Osservando le linee orizzontali, si può notare che beta due e MCP 21 fanno parte di tre complessi distinti. PA 28 è presente in uno solo di questi complessi. Pertanto, questi complessi MultiPro potrebbero essere identificati come il proteasoma 20 success e il proteasoma 20 s.Insieme a P 28 e al proteasoma 20 S da solo, abbiamo appena mostrato come separare e caratterizzare complessi MultiPro nativi da un lisato cellulare utilizzando la blue native page. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di dializzare attentamente il campione. Per evitare il contatto con SDS e lavorare sempre a quattro gradi, raccomandiamo di confrontare diversi detergenti per la lisi cellulare al fine di garantire sia l'integrità dei complessi proteici motori, sia la migliore solubilizzazione possibile.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti. Io esco.

blue-native-polyacrylamide-gel-electrophoresis-bn-page-for-analysis

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo articolo descrive una tecnica standard occidentale-blotting utilizzando la procedura disponibile sul mercato elettroforesi NuPAGE Mini-Gel sistema da Invitrogen.

Western Blotting Utilizzando il Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Questo video mostra una tecnica di separazione denaturante basata su poliacrilammide per proteine. Questa tecnica aiuta nell'identificazione preliminare delle proteine in base al loro peso molecolare.

Elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato per l'analisi delle proteine: una tecnica per separare e visualizzare le proteine in base al peso molecolare

In questo video, dimostriamo una tecnica elettroforetica, chiamata blue native PAGE, per l'analisi di complessi proteici respiratori mitocondriali nel loro stato nativamente ripiegato e funzionalmente attivo. Il colorante blu anionico Coomassie fa sì che i complessi proteici si carichino negativamente, consentendo la separazione in base alle dimensioni e alla struttura.

Elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo blu: una tecnica di separazione non denaturante per l'analisi di complessi di catene respiratorie mitocondriali intatti

Questo video descrive la PAGINA multimerica per la separazione di complessi proteici nativi da omogeneizzati tissutali. La tecnica è un ibrido tra le tecniche blue native-PAGE e SDS-PAGE. I complessi separati possono essere caratterizzati e studiati per il loro ruolo nel funzionamento cellulare.

Multimer-PAGE per la separazione di complessi proteici nativi: una tecnica di separazione ibrida costituita da Blue Native-PAGE e SDS-PAGE per separare le proteine multimeriche intatte dal lisato tissutale

In questo video, dimostriamo un metodo di elettroforesi su gel bidimensionale che separa singole proteine da una complessa miscela proteica ottenuta da tessuti tumorali di adenoma ipofisario umano non funzionale (NFPA). Le proteine vengono separate in base alla loro carica elettrica nella prima dimensione e ulteriormente separate in base ai pesi molecolari nella seconda dimensione.

Elettroforesi su gel di poliacrilammide bidimensionale: una tecnica di separazione per l'analisi delle proteine in una miscela proteica complessa basata sulla carica e sul peso molecolare

Questo protocollo descrive come preparare ed eseguire l'elettroforesi di intrappolamento della frazione liquida eluita in gel nativo chiaro (CN-GELFrEE), una tecnica di separazione nativa per assemblaggi biomolecolari non covalenti e proteine da campioni eterogenei compatibile con varie tecniche di analisi delle proteine a valle.

CN-GELFrEE - Clear nativo Gel-eluito Frazione Liquid Entrapment elettroforesi

Metodo per la stabilizzazione e la separazione complessi proteici nativi di lisato tessuto non modificato utilizzando una proteina reticolante amminico reattivo accoppiato ad un romanzo elettroforesi bidimensionale poliacrilammide sistema (PAGE) è presentato.

Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici

Presentiamo qui protocolli per purificazione per affinità di complessi proteici e la loro separazione dal blu PAGE nativa, seguiti da proteine ​​correlazione profilatura mediante un'etichetta disponibile spettrometria di massa quantitativa. Questo metodo è utile per risolvere interattomi in distinti complessi proteici.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Qui presentiamo un protocollo per analizzare la composizione proteica della grande proteina nativa: proteina e proteina: complessi di acidi nucleici da colza (b. napus) essudato floema utilizzando un approccio di elettroforesi (pagina) del gel di poliacrilammide 3D combinando blu nativo (BN) con due pagine di denaturazione seguita dall'identificazione spettrometria di massa.

Floema Sap campionamento da Brassica napus per 3D-pagina di proteine e complessi della ribonucleoproteina

Un protocollo per la delucidazione della pianta thylakoid proteina complessa organizzazione e composizione con blu nativo poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) e 2D-SDS-PAGE è descritto. Il protocollo è ottimizzato per Arabidopsis thaliana, , ma può essere utilizzato per altre specie di piante con modifiche minori.

Analisi dei complessi della proteina di membrana tilacoide mediante elettroforesi nativa blu

Per la profilazione complesso ad alta risoluzione viene presentato un versatile protocollo BN-MS crioscillante utilizzando un microtoma.

Profilazione complesso ad alta risoluzione di Cryoslicing BN-MS Analysis

Impara la caratterizzazione di complessi multiproteici mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide blu nativo (BN-PAGE) da lisati cellulari. Questa tecnica bidimensionale preserva le interazioni proteiche native.

Blu nativi poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) per l'analisi di complessi multiproteici da lisati cellulari

Esplora altri video