Name: I topi con Transnuclear predefiniti Specificità cellule T contro il recettore Toxoplasma gondii Ottenuto Via SCNT (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Scopri come generare modelli murini con specificità predefinite del recettore T-cellulare mediante trasferimento nucleare di cellule somatiche. Questo metodo consente di studiare risposte immunitarie in malattie autoimmuni, infezioni e cancro.

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Gli autori sono grati a H. Eisen, M. Gubbels, K. van Grinsven, E. Guillen, A. Drake, V. Mahajan, Q. Gao, e G. Yap per proficue discussioni e reagenti. Siamo grati a J. Dausman, R. Flannery, e J. Jackson per l&#39;assistenza con la gestione della colonia del mouse. Siamo grati a P. Wisniewski per FACSorting. EMF è stato sostenuto dal Programma di Scienze Umane Frontiere. RJ è stato sostenuto dal National Institute of concede Salute RO1-HD045022 e R37-CA084198. HLP è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institute of Health.

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/328/5975/243">Kirak et al. Science 328 (5975), 243-248 (2010)</a> . 1. Isolamento di cellule del donatore Prima di T specifici o cellule B possono essere utilizzati come cellule del donatore di generare modelli di topo transnuclear, topi devono essere infettato da un agente patogeno di interesse o immunizzati con un antigene di interesse. Dal momento che abbiamo usato cellule CD8 + specifiche per Toxoplasma gondii, il seguente protocollo descrive la generazione e l'isolamento di queste cellule e deve essere adattata in base agli interessi personali. <ol><li> Cisti derivata da un omogenato cervello di topo (circa 40) sono iniettati intra-peritoneally in BL / 6 x Balb / c F1 (B6CF1) topi, che consente l'isolamento di entrambe le H-2 b e H-2 d limitato cellule T CD8 +. </li><li> Al culmine della risposta immunitaria, il topo infetto è eutanasia, la milza isolati e messi in un piatto contenente 6 ml di globuli rossi (RBC) tampone di lisi. </li><li> Utilizzando i lati smerigliato di due scivoli di copertura, la milza è attentamente terra e incubato nel buffer di lisi per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 14 ml di PBS, filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellula (40 o 70 micron) in una provetta da 50 ml falco e centrifugare per 5 min a 300 gr. </li><li> Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 ml di PBS e trasferire in una provetta 1,5 ml Eppendorf. Centrifugare per 5 minuti a 300g e rimuovere il surnatante dopo. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 50 microlitri di PBS, aggiungere gli anticorpi fluorescente per identificare il tipo di cellula di interesse (ad es CD3, B220, CD8 e CD4), e fluorescente MHC-I tetramero (MHC-II tetramero di cellule T CD4) caricato con il peptide di interesse alla sospensione cellulare e incubare per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 1 ml di PBS, centrifugare per 5 min a 300 g, risospendere pellet in 3 ml di PBS e filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cellula (40 o 70 micron) in una provetta. </li><li> Eseguire FACSorting impostando le porte rigorosamente (Figura 1B). </li></ol> 2. Cellule somatiche Ci sono un paio di protocolli per il trasferimento nucleare di cellule somatiche. Quella descritta qui fa uso di ovociti arrestate in metafase-II e l'inibizione della seconda divisione meiotica con citocalasina B. Pertanto le cellule del donatore sono necessari che sono in fase G0/G1. <ol><li> Preparazione degli ovociti <ol><li> Topi di sesso femminile di BDF1 sfondo vengono iniettati all'interno peritoneally con 5IU PMS per il mouse 05:00-7:00. </li><li> Circa 47 ore più tardi, ogni mouse viene iniettato all'interno peritoneally con HCG 5IU. </li><li> Preparare un piatto di cultura (KSOM-AA scende sotto olio) per gli ovociti, il giorno stesso l'iniezione di HCG e metterli in un incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2. Inoltre, preparare gli aghi necessari per SCNT (7μm per l'enucleazione e 4 o 5 micron per il trasferimento nucleare di nuclei di linfociti), caricandoli con il mercurio. </li><li> Euthanize topi e isolare ovidotti circa 13h dopo HCG (circa 8:00). Raccogliere gli ovidotti in 1-2 gocce di HCZB. </li><li> Uno per uno spostare il ovidotti in una goccia contenente M2 w / ialuronidasi. Nick the ovidotto accuratamente con un pinza e spostare l'ovocita-cumulo-complesso in calo. Dopo tutto ovocita-cumulo-complessi sono stati isolati, il piatto viene incubata a 37 ° C. </li><li> Dopo 2-5 minuti (il tempo esatto dipende dal lotto di ialuronidasi) raccogliere gli ovociti, lavare in HCZB e la piastra li in KSOM-AA gocce. </li></ol></li><li> Enucleazione degli ovociti <ol><li> Utilizzare il coperchio di una capsula di Petri per preparare il piatto SCNT. Impostare il microscopio e il micromanipolatore. </li><li> Lavare l'ago enucleazione (7 micron) in PVP prima di iniziare con l'enucleazione. </li><li> Per enucleazione, posto un gruppo di ovociti (10-30) in una goccia di HZCB con citocalasina B (5 mg / mL). Durante l'incubazione (min. 5 min) line-up degli ovociti orizzontalmente. </li><li> Prendete un ovocita e posto di fronte a l'ago in mano. Fissare l'ovocita per l'ago tenendo mediante l'applicazione di un vuoto. Utilizzando l'ago enucleazione, girare l'ovocita fino a quando il cromosoma-fuso-complessi (CSC, spesso chiamato il "nucleo") è in posizione ore 3. </li><li> Utilizzando piezo-pulse penetrare la zona pellucida con attenzione senza danneggiare l'ovocita. Luogo l'apertura dell'ago adiacente alla metafase II mandrino e applicare il vuoto. Il "nucleo" dovrebbe lentamente entrare nella ago, e la membrana dovrebbe sigillare una volta che è completamente rimosso. </li><li> Trasferire il ovociti enucleati indietro nel KSOM-AA gocce, e lavarli più volte. Ripetere l'indirizzo enucleazione passi con un nuovo gruppo di ovociti. Continuare fino a quando tutte le uova sono enucleato o fino a circa 11:00. </li></ol></li><li> Trasferimento nucleare <ol><li> Per il trasferimento nucleare, cambio l'ago enucleazione (7 micron) con un ago di trasferimento nucleare (4 o 5 micron) e lavarlo con PVP. </li><li> Luogo le cellule di interesse (ad esempio cellule T CD8 +) in una caduta con PVP, mescolare bene e incubare per un minimo di 10 min. </li><li> Posizionare un gruppo di ovociti enucleato (10-30) in una goccia di HCZB con citocalasina B (2,5 mg / ml). Durante l'incubazione (min. 5 min) line-up degli ovociti in posizione orizzontale utilizzando l'ago di trasferimento nucleare. </li><li> Prendete una cellula donatrice dal PVP-cell sospensione e aspirare in-e-out fino a quando la membrana esterna ha abbattuto (frammenti della membrana e citoplasma dovrebbe essere visibile). Se necessario, un piezo-impulso può essere applicata. Una volta che un nucleo è stato isolato, sposta un po 'fino a l'ago, e continuano a raccogliere i nuclei fino ad avere 10-30. </li><li> Sposta la goccia contenente gli ovociti enucleati allineati. Fissare un ovocita per l'ago tenendo applicando vuoto. Posizionare l'ago trasferimento nucleare (i nuclei dovrebbe essere lontano dalla apertura) adiacente alla zona pellucida e applicare piezo impulsi fino a quando l'ago è passato attraverso la zona pellucida. Muovere con cautela un nucleo alla punta dell'ago, spingere l'ago nel citoplasma dell'ovocita fino a quando la punta dell'ago è 2 / 3 all'interno. Applicare una piccola pressione negativa, in modo che un po 'della membrana dell'ovocita è l'ago. </li><li> Il passo successivo è molto critica, poiché è l'unica volta in cui l'ovocita è in realtà "aperta". Applicare un singolo impulso di piezo, spingere il nucleo fuori l'ago, applicando una pressione positiva, con attenzione tirare indietro l'ago in modo che la punta è circa 1 / 3 nell'ovocita, e quindi applicare una pressione negativa e continuare a tirare indietro l'ago sigillare l'ovocita. Ripetere questo passaggio con ogni ovocita. </li><li> Dopo tutti gli ovociti di un gruppo hanno ricevuto un nucleo, vengono lavate e coltivate in KSOM-AA media. Ripetete questa procedura con tutti gli ovociti. </li><li> Dopo l'ultimo gruppo è stata culture in KSOM-AA per un minimo di 30 minuti, il SCNT-embrioni vengono trasferiti in gocce di Ca-multimediale gratuito attivazione contenente SrCl2. </li><li> Dopo 6 ore di attivazione, la quantità di pseudo-pronuclei (PPN)-positivi SCNT-embrioni è determinata. Gli embrioni vengono poi lavate e coltivate in KSOM-AA gocce per altri 3,5 giorni fino a quando hanno raggiunto lo stadio di blastocisti. </li><li> Farmaci o sostanze chimiche di scelta (come la tricostatina A) può essere aggiunto alla attivazione e terreni di coltura. </li></ol></li></ol> 3.Derivation delle cellule staminali embrionali Il SCNT-blastocisti può essere utilizzato sia per trasferirli in pseudo-femmine gravide (noto anche come clonazione diretta o one-step) o per ottenere cellule staminali embrionali (noto anche come clonazione indiretti o due fasi). Dal momento che è molto più efficiente per generare cellule staminali embrionali, scegliamo la procedura in due fasi. Nel caso in cui lo scienziato è interessato nella clonazione diretta, la blastocisti possono essere trasferiti direttamente in pseudo-femmine gravide, come descritto nella sezione 5. Ci sono molti protocolli descrivono la derivazione di cellule staminali embrionali. Quello qui descritto è una tecnica standard, che utilizza le cellule di alimentazione, e siero fetale di vitello. <ol><li> Il secondo giorno dopo il trasferimento nucleare, preparare un piatto 96-U-e per la derivazione delle cellule ES. </li><li> Aggiungere 100 ul gelatina in ciascun pozzetto di una piastra 96-U-bene, incubare per un minimo di 10 minuti, e rimuoverlo in seguito. </li><li> Cellule alimentatore disgelo e risospendere in un volume a seconda del mezzo ESD, ad esempio, le cellule di alimentazione pari a una superficie di 25 cm 2 sono risospesi in 10 ml di mezzo di scariche elettrostatiche e 200 ml di sospensione cellulare viene aggiunto in ciascuno dei gelatina-trattati bene. </li><li> Mettere la piastra in un incubatore e la cultura a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Dopo 3,5 giorni, gli embrioni dovrebbero essere allo stadio di blastocisti. </li><li> Preparare un piatto sterile batterica da placcatura poche gocce di medie ES cellulare e thyrode acido. </li><li> La blastocisti sono prima trasferite dal KSOM-AA scende in gocce contenenti normale media delle cellule ES e lavato due volte. </li><li> Cura il trasferimento di un gruppo di blastocisti (blastocisti 5-10) in una goccia di thyrode acide e tenere lì fino alla zona pellucida si è dissolto. </li><li> Le blastocisti sono poi trasferiti in una goccia di media ES, lavato due volte, e poi messo nell'alimentatore rivestite 96-U-pozzetti (una blastocisti in un pozzo). </li><li> Gli embrioni vengono poi coltivate per 5-7 giorni in incubatrice a 37 ° C, 5% di CO 2 senza disturbarli. Questo dà il tempo ad un embrionettach allo strato alimentatore, e di formare una conseguenza. </li><li> Preparare 24 pozzetti, con circuiti elettrici placcatura in media ESD in ciascun pozzetto, ad esempio, risospendere un equivalente di 50 cm 2 alimentatore in 12 ml di mezzo di scariche elettrostatiche, e aggiungere 500 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto. </li><li> Rimuovere con attenzione il supporto ESD dalla piastra 96-U-bene con gli embrioni, lavare ogni pozzetto due volte con 250 microlitri Hepes (o PBS), aggiungere 50 microlitri tripsina e incubare per circa 5 minuti a 37 ° C. </li><li> Pipetta su e giù più volte, fino a quando escrescenza si è sfasciata in una cella singola sospensione, trasferimento in un 24-pozzetti ed incubare a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Se la derivazione ESC ha avuto successo, colonie CES dovrebbe essere visibile dopo 7-10 giorni. </li></ol> 4.Blastocyst iniezione L'iniezione di blastocisti è una tecnica di routine per generare qualsiasi tipo di modello di topo transgenico. E 'importante ricordare che l'iniezione di blastocisti e il successivo trasferimento in pseudo-donne incinta ha bisogno di essere cronometrati bene. <ol><li> Primo topi femmina con PMS e HCG, come descritto nella sezione 2.1. Dopo l'iniezione di HCG mettere topi femmina insieme a topi maschi (una femmina ed un topo maschio per gabbia). </li><li> Il giorno seguente, controllare le femmine per spine. Questo viene conteggiato come 0.5dpc (giorni post coito). </li><li> Embrioni fecondati vengono poi isolate dal ovidotto, come descritto nella sezione 2.1, e colto in KSOM-AA per ulteriori 3 giorni. </li><li> Preparare le cellule ES, al momento della iniezione blastocisti (3.5dpc). </li><li> Rimuovere medio a partire da cellule ES, lavare due volte con Hepes (o PBS), aggiungere tripsina e incubare per 5 minuti a 37 ° C. </li><li> Risospendere le cellule trypsinized con media ES, piatto in un piatto, e incubare per 45-60 minuti a 37 ° C, 5% di CO 2 per ridurre la quantità di cellule di alimentazione (alimentatore cellule aderiscono più velocemente rispetto alle cellule ES). </li><li> Trasferire la sospensione cellulare attraverso un colino cellula (40 o 70 micron) in una provetta e centrifugare per 5 min a 1000rpm. </li><li> Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di media ES e memorizzare su ghiaccio fino al momento dell'uso. </li><li> Preparare il coperchio di un piatto sterile batterica da gocce placcatura contenente PVP e HCZB. </li><li> Preparare un 15 ago micron caricando con il mercurio, collocandolo in posizione e il lavaggio con PVP. </li><li> Posizionare un gruppo di blastocisti (10-30 blastocisti) in una goccia con HCZB, e aggiungere 5-50 microlitri della sospensione di cellule ES (dipende dalla concentrazione) in un'altra goccia di HCZB. </li><li> Raccogliere le cellule ES (50-100 cellule) con l'ago di iniezione. </li><li> Sposta la goccia con le blastocisti. Allineare la blastocisti in orizzontale, e fissare una con l'ago tenendo applicando vuoto. </li><li> Utilizzando l'ago di iniezione girare la blastocisti fino a quando la massa cellulare interna (ICM) è nella posizione ore 9. </li><li> Posizionare l'ago di iniezione a ore 3, assicurarsi che non ci sono cellule staminali sulla punta dell'ago, e applicare piezo-impulso che l'ago dell'iniezione penetra attraverso la zona pellucida e la trophectoderm nel blastocele. </li><li> Rilasciare un paio di cellule ES (5-15 cellule), in modo che le cellule ES bastone per l'ICM. Continuare fino a quando tutti blastocisti di un gruppo sono state iniettate cellule ES. </li><li> Dopo un gruppo di blastocisti è finito, lavarli due volte in KSOM-AA e tenerli in una goccia con KSOM-AA fino a quando tutti blastocisti vengono iniettati. </li></ol> 5. Embryo Transfer Il trasferimento di embrioni in pseudo-femmine gravide rappresenta una procedura chirurgica, che deve essere effettuata con molta attenzione e secondo le linee guida di istituto del ricercatore. <ol><li> Anestetizzare topi riceventi femminile, la barba quadrante inferiore destro, e da disinfettare. </li><li> Utilizzando le forbici aperte sulla pelle, e separare il peritoneo dalla pelle. </li><li> Individuare l'ovaio attraverso il peritoneo (macchia rossa), e aprire il peritoneo in prossimità dell'ovaio. </li><li> Utilizzando una pinza, con attenzione afferrare il ovidotto e tirare fuori l'utero. </li><li> Prendete un gruppo di circa 10 blastocisti con un capillare collegato ad una pipetta a bocca. </li><li> Fissare l'utero con una pinza, pugno nel suo complesso in piccolo con un piccolo ago, e inserire il capillare con le blastocisti nel lume dell'utero. </li><li> Con attenzione rilascio degli embrioni in utero, e rimuovere il capillare. </li><li> Spingere l'utero indietro nella cavità addominale. </li><li> Individuare i margini del peritoneo e chiudere con un paio di punti. </li><li> Chiudere la pelle del mouse con un paio di graffette. </li><li> Per dolore post-operatorio, somministrare 5 mg Carprofen per mg di peso corporeo. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Nucleare di cellule somatichetrasferimento di pre-definite cellule T in B6CF1 sfondo. Numeri assoluti e relativi di embrioni generati da cellule CD8 + T e le cellule staminali embrionali derivate da blastocisti SCNT. <img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Analisi del flusso rappresentante citometria di topi chimerici con SCNT iniettato cellule staminali embrionali. Cancello e numero (cento per totali cellule T CD8 +) indica la presenza di specifiche cellule CD8 + T nei topi chimerici.

<ol><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">V(D)J recombination.</a> Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).</li>
<li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).</li>
<li>Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).</li>
<li>Kishigami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).</li>
<li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cloning+with+nucleus+donor+cells+of+different+age+and+type%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type.</a> Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).</li>
</ol>

Abbiamo dimostrato qui che SCNT può essere utilizzato per generare topi transnuclear dalle cellule T con pre-definiti specificità. Anche se non qui, la tecnica dovrebbe anche essere utilizzabile per generare topi transnuclear da cellule B pre-definita specificità. Una cosa importante da considerare è il ceppo e il sesso di topo, che è stato infettato o immunizzate e per isolare le cellule T o B di interesse. Dato che le cellule T e B hanno un rendimento molto basso riprogrammazione in generale, si consiglia di utilizzare ibridi F1 di aplotipo desiderato. Poiché la cellula donatrice determina anche il sesso, si consiglia di utilizzare T o linfociti B di topi maschi. Questo significa che solo i topi maschi chimerici trasmetterebbe le BCR o TCR attraverso la linea germinale, con i topi maschi è stato più facile e veloce per riprodursi. Nel loro insieme, pensiamo che riprogrammazione epigenetica tramite SCNT rappresenta un potente strumento per generare un nuovo tipo di modelli di mouse, che sarà di grande vantaggio per il campo immunologico.

<table><tbody><tr><td>Tampone di lisi dei globuli rossi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per cellule</td><td>BD Biosciences</td><td>REF 352340</td><td></td></tr><tr><td>Serum di cavalla gravida (PMS)</td><td>Calbiochem</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina corionica umana (HCG)</td><td>Calbiochem</td><td>230734</td><td></td></tr><tr><td>Ialuronidasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4272</td><td>Tipo IV-S</td></tr><tr><td>KSOM-AA</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>HCZB</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-173-D</td><td>Mezzo personalizzato</td></tr><tr><td>Mezzo senza calcio per l'attivazione</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-174-D</td><td>Mezzo personalizzato</td></tr><tr><td>SrCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255521</td><td>100 mM = 10x</td></tr><tr><td>AlbuMAX I</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>PVP</td><td>MP Biomedicals</td><td>102787</td><td>Preparare una soluzione al 10% usando HCZB e aggiungere AlbuMAX I allo 0,1%</td></tr><tr><td>Citocalasina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td>500&amp;#x03BC;g/ml = 100x</td></tr><tr><td>Tricostatina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td>5 mM = 1000x</td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>Ago di fissaggio</td><td>Humagen</td><td>MPH-SM-30</td><td></td></tr><tr><td>Aghi per iniezione e trasferimento</td><td>Humagen</td><td>4-15, 7-15, 15-15</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta a bocca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>o strumento simile</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>o strumento simile</td></tr><tr><td>Applicatore di clip per ferite</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Clip per ferite</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgia filo</td><td>Ethicon Inc.</td><td>K871H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>15%</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-602E</td><td>100x</td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>MP Biomedicals</td><td>101806</td><td>200 mM = 100x</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td>100x</td></tr><tr><td>&amp;#946;-Mercapto&amp;#8211;etanolo</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>5&amp;#x03BC;l in 500 ml</td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1106</td><td>1000x</td></tr><tr><td>Inibitore della MEK</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9900L</td><td>Per derivazione di cellule ES soltanto, aggiungere al mezzo per cellule ES (concentrazione finale 50&amp;#x03BC;M)</td></tr></tbody></table>

i topi con transnuclear predefiniti specificità cellule t contro il recettore toxoplasma gondii ottenuto via scnt

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Linfociti, come le cellule T, sottoposti genetica V (D) J ricombinazione, per generare un recettore con una certa specificità 1. Topi transgenici per un riarrangiati antigene-specifici recettori delle cellule T (TCR) è stato uno strumento indispensabile per studiare lo sviluppo delle cellule T e la funzione. Tuttavia, TCR quali di solito sono isolate dalle cellule T rilevante dopo un lungo periodo la cultura spesso a seguito di stimolazione antigenica ripetuta, che seleziona inevitabilmente per le cellule T con alta affinità. Casuale integrazione genomica del TCR α e β-chain e di espressione da non endogena promotori possono portare a variazioni nel livello di espressione e cinetica. Riprogrammazione epigenetica tramite trasferimento nucleare di cellule somatiche fornisce uno strumento per generare cellule staminali embrionali e topi da qualsiasi cellula di interesse. Di conseguenza, quando SCNT è applicato alle cellule T di specificità noto, questi genetica V (D) J riarrangiamenti sono trasferite al SCNT-cellule embrionali staminali (ESC) e dei topi che ne derivano, mentre segnali epigenetici vengono azzerati. Abbiamo dimostrato che le cellule T con pre-definiti specificità contro Toxoplasma gondii può essere usato per generare modelli di topo che esprimono il TCR specifico dal loro loci endogene, senza modificazione genetica introdotta sperimentalmente. La relativa facilità e la velocità con cui tali modelli possono essere ottenuti transnuclear promettente per la costruzione di modelli di altre malattie.

Dimostriamo qui che riprogrammazione epigenetica tramite trasferimento nucleare di cellule somatiche (SCNT) può essere utilizzato come uno strumento per generare modelli di topo con pre-definito recettore delle cellule T (TCR) specificità. Questi topi transnuclear esprimono il corrispondente TCR dal loro luogo endogena sotto il controllo del promotore endogeno.

I topi con Transnuclear predefiniti Specificità cellule T contro il recettore Toxoplasma gondii Ottenuto Via SCNT

I linfociti, come le cellule T, subiscono la ricombinazione genetica V(D)J per generare un recettore con una determinata specificità1. Topi transgenici per un ...

Topi transgenici per recettori specifici di antigeni delle cellule T si sono rivelati indispensabili nello studio dello sviluppo e della funzione delle cellule T, al fine di generare modelli murini con specificità predefinite del recettore delle cellule T mediante trasferimento nucleare di cellule somatiche o SCNT. Un topo viene infettato con un patogeno di interesse. Le cellule T vengono isolate dal topo e successivamente purificate mediante sorting cellulare attivato da fluorescenza.I linfociti T purificati vengono quindi utilizzati per il trasferimento nucleare di cellule somatiche. Dopo che gli embrioni raggiungono lo stadio di blastula, vengono isolate cellule staminali embrionali. Queste cellule vengono quindi iniettate in blastocisti, che a loro volta vengono trasferite in topi pseudo-gravidi.I cuccioli risultanti mostrano un marcato aumento della popolazione di cellule T di interesse, che può essere convalidato mediante analisi PAX. Ciao, mi chiamo Okta AK e sono un post dottorato presso l'Istituto White per la Ricerca Biomedica. Oggi vi mostrerò come eseguire iniezioni somatiche di trasferimento blastocistico assistito da CLE, nonché il trasferimento embrionale.Il vantaggio principale del trasferimento somatico è che possono essere generati modelli murini che esprimono il loro recettore per cellule T dal locus endogeno, e quindi sotto il controllo del promotore endogeno, e che tali modelli murini possono essere ottenuti molto rapidamente. Il trasferimento somatico in forma liquida può essere utilizzato come strumento per generare modelli murini con specificità predefinite di recettori per cellule T o per cellule B. Questo è di particolare interesse per chi lavora in campi come l'autoimmunità, le malattie infettive e il cancro.Per isolare linfociti T specifici per un patogeno come Toxoplasma gondii, si infetta il topo donatore mediante iniezione intraperitoneale e si prelevia la milza al culmine della risposta immunitaria; le cellule omogeneizzate del donatore vengono quindi isolate e incubate con anticorpi marcati fluorescentemente e il tetramero appropriato. Infine, si esegue il sorting mediante citometria a flusso per ottenere linfociti T specifici per il patogeno. La sera prima della procedura di enucleazione degli oociti.Preparare aghi per iniezione piso di quattro, cinque e sette micrometri utilizzando una siringa per caricarli retrogradamente con mercurio. Il giorno successivo, iniziare il protocollo di trasferimento nucleare di cellula somatica raccogliendo gli oociti, quindi, mediante pipetta a bocca, trasferirli in gocce di mezzo K-S-O-M-A-A in una piastra di Petri. Nel coperchio della piastra di Petri.Preparare una piastra per eseguire il trasferimento nucleare di cellule somatiche o SCNT posizionando circa 10 gocce di PVP. Aggiungere circa 10 gocce di HCZB contenente cinque microgrammi per millilitro di citocalasina B e circa 10 gocce di HCCB contenente 2,5 microgrammi per millilitro di citocalasina B. Questa piastra sarà indicata come piastra S-C-N-T-A. Posizionare la piastra S-C-N-T-A sul portapreparati di un microscopio composto invertito.Successivamente, inserire un ago per enucleazione di sette micrometri nel micro manipolatore e lavarlo aspirando e scartando la soluzione di PVP da cinque a 10 volte. Trasferire quindi da 10 a 30 cellule arrestate in metafase II dalla piastra di Petri in una delle gocce di HCCB con cinque microgrammi per millilitro di citocalasina B sulla piastra S-C-N-T-A e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, allineare gli oociti in orizzontale.Trascorsi cinque minuti, utilizzare l'ago per enucleazione per posizionare un ovocita davanti all'ago di ritenzione. Utilizzando un microiniettore, applicare un vuoto per fissare l'ovocita all'ago di ritenzione della micropipetta.Successivamente, utilizzando l'ago per enucleazione, ruotare l'ovocita finché il complesso cromosomico del fuso, che appare ipertrasparente rispetto al citoplasma opaco, si trovi nella posizione delle tre in punto; quindi attivare un impulso piezoelettrico premendo il pedale per penetrare la zonapellucida. Un impulso piezoelettrico è un impulso meccanico che si propaga longitudinalmente e fa vibrare la punta dell'ago di enucleazione. Le vibrazioni della punta facilitano la perforazione della zonapellucida.Dopo aver attraversato la zona pellucida, posizionare l'apertura dell'ago di nucleazione adiacente al fuso della metafase II ed applicare il vuoto. Il complesso cromosomico del fuso si sposterà lentamente all'interno dell'ago. Una volta rimosso l'ago, la membrana dovrebbe sigillarsi autonomamente.Infine, utilizzando una pipetta a bocca, trasferire i citi enucleati nuovamente nelle gocce di K-S-O-M-A-A. Successivamente, utilizzando la stessa pipetta, lavarli trasferendoli da una goccia all'altra di KSOM AA. Per eseguire il trasferimento nucleare, sostituire l'ago da sette micrometri utilizzato per l'enucleazione sul micromanipolatore con un ago da quattro a cinque micrometri destinato al trasferimento nucleare. Lavare l'ago con PVP come in precedenza.Posizionare le cellule T CD8 positive isolate in precedenza in una goccia di PVP sulla piastra S-C-N-D-A. Mescolare bene e incubare per almeno 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire da 10 a 30 cellule ENUCLEATE in una goccia di HCZB contenente 2,5 microgrammi per millilitro.Cyto B sulla piastra S ct. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, utilizzare l'ago per il trasferimento nucleare per allineare i citi in orizzontale usando l'ago di iniezione.Prelevare una cellula donatrice CD8 positiva dal mezzo PVP e aspirarla avanti e indietro finché la membrana esterna non si sarà disintegrata. Se necessario, applicare un impulso piezoelettrico: frammenti di membrana e citosol dovrebbero risultare visibili. Aspirare il nucleo all'interno dell'ago.Quindi continuare a raccogliere nuclei fino a quando non ce ne sono da 10 a 30. Successivamente, spostarsi sulla goccia contenente gli oociti anucleati allineati. Applicare il vuoto per fissare un oocita all'ago di ritenzione.Quindi posizionare l'ago per il trasferimento nucleare NU accanto alla zona pellucida con i nuclei orientati in direzione opposta rispetto all'apertura. Applicare un impulso piezoelettrico fino a quando l'ago non ha attraversato la zona pellucida. Spingere il micromanipolatore per spostare con attenzione un nucleo fino alla punta dell'ago.Inserire l'ago nell'oocita fino a quando la punta dell'ago si trova a due terzi della profondità totale. Applicare una leggera pressione negativa in modo che una piccola parte della membrana dell'oocita entri nell'ago. Il passaggio successivo è molto critico.Poiché è l'unico momento in cui l'ovocita è effettivamente aperto. Applicare un singolo impulso ZO. Quindi applicare una pressione positiva per spingere il nucleo fuori dall'ago.Ritirare con attenzione l'ago in modo che la punta si trovi a circa un terzo della profondità nell'ovocita, quindi applicare una pressione negativa e continuare a ritirare l'ago. Per sigillare l'ovocita. Ripetere questo passaggio con ogni ovocita.Dopo che tutti gli oociti hanno ricevuto un nucleo, trasferirli nella piastra di Petri e lavarli spostandoli da una goccia all'altra di mezzo KS OM AA, quindi incubare a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Al termine dell'incubazione, trasferire gli embrioni SCN T in gocce di mezzo di attivazione senza calcio contenente cloruro di stronzio. Il cloruro di stronzio attiva l'ocite inducendo oscillazioni del calcio che si verificherebbero in modo simile durante la fecondazione.Incubare per sei ore. Se desiderato, aggiungere TSA, un inibitore non specifico delle istone deacetilasi, al mezzo di attivazione. Al fine di valutare l'efficienza successiva all'attivazione, esaminare gli embrioni al microscopio invertito per determinare la quantità di pseudo pronuclei o embrioni SCNT positivi per PPN. I PPN possono essere identificati in base al loro aspetto.Sembrano uova. Lavare e coltivare alla maniera "sunny side up". Gli embrioni e le gocce di K-S-O-M-A-A vengono incubate per tre giorni e mezzo a 37 gradi Celsius fino al raggiungimento dello stadio di blastocisti.All'inizio, dovresti concentrarti sull'esecuzione corretta delle procedure che ti abbiamo appena mostrato per la nucleazione e il trasferimento nucleare NU. Una volta padroneggiate queste tecniche, le procedure successive saranno più facili da gestire. Le cellule staminali embrionali o cellule ES utilizzate qui sono state ottenute mediante tecniche standard.Questi devono essere preparati nel giorno dell'iniezione assistita da blast, tre giorni e mezzo dopo il coito. Preparare il coperchio di una piastra batteriologica sterile piastrando gocce contenenti PVP e HCZP. Quindi preparare un ago per iniezione da 15 micrometri per l'impulso piso come in precedenza.Successivamente, posizionare l'ago di iniezione nel micromanipolatore e lavarlo con il trasferimento di PVP. Eseguire da 10 a 30 assist di blast in una goccia di HCZB. Quindi, posizionare da cinque a cinquanta microlitri della sospensione ESL in un'altra goccia di HCZB.Devono essere presenti abbastanza cellule staminali embrionali (ES) da poter essere facilmente raccolte, ma senza essere troppo fitte. Successivamente, raccogliere da 30 a 100 cellule staminali embrionali con l'ago di iniezione. Procedere quindi alla goccia con il blast assist. Allineare orizzontalmente l'assistente per la blastocisti e fissarne uno con l'ago di contenimento applicando il vuoto. Utilizzare l'ago di iniezione per ruotare l'assistente per la blastocisti finché la massa cellulare interna non si trova alle nove in punto. Posizionare l'ago di iniezione alle tre in punto.Assicurarsi che non ci siano cellule staminali embrionali sulla punta dell'ago e applicare un impulso piso fino a quando l'ago di iniezione penetra attraverso la zop lucita e la trifecta nel sigillo blastico. Rilasciare da cinque a quindici cellule staminali embrionali in modo che aderiscano alla massa cellulare interna. Proseguire fino a quando tutti i blast assist sono stati iniettati; al termine delle iniezioni, concludere l'operazione.Lavare due volte in K-S-O-M-A-A e procedere al trasferimento chirurgico dell'embrione in femmine pseudogravide, posizionando la ricevente femmina pseudogravida anestetizzata nell'area chirurgica. Utilizzando un rasoio elettrico, rimuovere i peli dal quadrante inferiore destro. Disinfettare la zona utilizzando una soluzione a base di iodio e alcol al 70% sotto un microscopio stereoscopico.Usare le forbici per aprire la pelle, quindi inserire le forbici chiuse tra la pelle e il peritoneo e aprirle per separare il peritoneo dalla pelle. Individuare l'ovaio attraverso il peritoneo, che dovrebbe apparire come una macchia rossa. Quindi usare le forbici per aprire il peritoneo in quella zona.Utilizzare una pinzetta per afferrare con cura il dotto uterino comune (UCT) o il tessuto adiposo circostante ed estrarre l'utero mediante una capillare collegata a una pipetta azionata dalla bocca. Prelevare un gruppo di circa 10 blastocisti tenendo l'ovidotto e l'utero con la pinzetta. Utilizzare un ago per praticare un piccolo foro nell'utero.Quindi inserire il capillare con l'ausilio della blast nell'ampolla uterina e rilasciarli. Riposizionare l'utero all'interno della cavità addominale. Individuare i margini del peritoneo e chiuderli con alcuni punti di sutura.Chiudere la cute del topo con alcune graffette. Somministrare un antidolorifico per via sottocutanea. Successivamente, trasferire il topo nella sua gabbia sotto una lampada riscaldante.Monitorare la respirazione del topo fino al suo risveglio. Successivamente all'enucleazione e al trasferimento nucleare di cellule somatiche. Circa il 70% degli embrioni era positivo per i pseudopronuclei.Come mostrato in questa figura, il trattamento con TSA per sei o dieci ore non ha avuto alcun effetto. Dopo tre giorni e mezzo di coltura, dal 5 al 10% degli embrioni si è sviluppato in blastoisti.Anche in questo caso, l'aggiunta di TSA non ha avuto alcun effetto sulla velocità di sviluppo del blasto assistito. I blasto assistiti SCNT sono stati quindi utilizzati per ottenere cellule staminali embrionali. TSA ha migliorato significativamente la frequenza con cui le ESL sono state derivate dal blasto assistito.Le cellule S-C-N-T-E-S vengono utilizzate per generare topi chimerici. Viene prelevato sangue da questi topi e analizzato per rilevare la presenza di specifiche cellule T mediante analisi facts, come mostrato qui. Quando il sangue viene colorato con anticorpo anti-CDA e tetramero specifico, può essere identificata una popolazione doppio positiva.Indica che la cellula donatrice utilizzata per il trasferimento nucleare da cellule somatiche (SCNT) era della specificità corretta. Vi ho appena mostrato come eseguire il trasferimento nucleare da cellule somatiche, le iniezioni assistite da blastocisti e il trasferimento di embrioni. Il punto più importante da considerare è la purezza delle vostre cellule T o cellule B.Dopo aver appreso come eseguire il trasferimento somatico e una volta che i vostri embrioni hanno raggiunto lo stadio di blastocisti, potete scegliere se trasferirli direttamente in femmine pseudo-gravide oppure utilizzarli per ricavare cellule staminali embrionali e generare topi chimerici.

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