I topi con Transnuclear predefiniti Specificità cellule T contro il recettore Toxoplasma gondii Ottenuto Via SCNT

I topi transgenici per i recettori delle cellule T antigene specifici sono stati indispensabili nello studio dello sviluppo e della funzione delle cellule T per generare modelli murini con specificità predefinite del recettore delle cellule T utilizzando il trasferimento nucleare di cellule somatiche o SCNT. Un topo è stato infettato da un agente patogeno di interesse. Le cellule T vengono isolate dal topo e quindi purificate mediante smistamento cellulare attivato fluorescente.

Le cellule T purificate vengono quindi utilizzate per il trasferimento nucleare delle cellule somatiche. Dopo che gli embrioni hanno raggiunto lo stadio blastico, le cellule staminali embrionali vengono isolate. Queste cellule vengono quindi iniettate nell'assistenza blastica, che vengono poi trasferite a topi pseudo gravidi.

I cuccioli risultanti esprimono un aumento pronunciato della popolazione di cellule T di interesse, che può essere convalidato dall'analisi PAX. Ciao, mi chiamo Okta AK e sono un postoc qui al White Institute for Biomedical Research. Oggi ti mostrerò come eseguire le iniezioni somatiche di trasferimento CLE blast assist e il trasferimento embr.

Il vantaggio principale del trasferimento somatico è che possono essere generati modelli murini, che esprimono il loro recettore delle cellule T dal locus endogeno, e quindi sotto il controllo del promotore endogeno e che i modelli murini possono essere generati molto velocemente. Il trasferimento di liquidi di invio somatico può essere utilizzato come strumento per generare modelli murini con specificità predefinite del recettore delle cellule T o del recettore delle cellule B. Questo è di particolare interesse per le persone che lavorano nel campo come l'autoimmunità, le malattie infettive e il cancro.

Per isolare le cellule T specifiche per un patogeno come il Toxoplasma Gandhi, avaro infettato dall'iniezione intraperitoneale al culmine della risposta immunitaria, la milza viene isolata dal topo eutanasia e le cellule del donatore omogeneizzate vengono quindi isolate e incubate con anticorpi marcati in fluorescenza e il tetramero appropriato. Infine, viene eseguito il fact sorting per ottenere cellule T specifiche del patogeno. La sera prima della procedura di enucleazione degli ovociti.

Preparare aghi per iniezione di piso da quattro, cinque e sette micrometri utilizzando una siringa per caricarli retrogradamente con mercurio. Il giorno successivo, iniziare il protocollo di trasferimento nucleare delle cellule somatiche raccogliendo gli ovociti, quindi utilizzando una pipetta orale, trasferirli in gocce di terreno K-S-O-M-A-A in una capsula di Petri. Nel coperchio della capsula di Petri.

Preparare l'aate per l'esecuzione del trasferimento nucleare di cellule somatiche o SCNT posizionando circa 10 gocce di PVP. Circa 10 gocce di HCZB contenenti cinque microgrammi per millilitro di cito B e circa 10 gocce di HCCB contenenti 2,5 microgrammi per millilitro di cito B.Questa piastra sarà indicata come la piastra S-C-N-T-A. Posizionare la piastra S-C-N-T-A sul tavolino di un microscopio composto invertito.

Successivamente, posizionare un ago per enucleazione da sette micrometri nel micromanipolatore e lavarlo immergendolo nella soluzione PVP da cinque a 10 volte. Quindi trasferire da 10 a 30 due citi arrestati in metafase dalla capsula di Petri in una delle gocce di HCCB con cinque microgrammi per millilitro. Cyto B sulla piastra S-C-N-T-A incubare per cinque minuti a temperatura ambiente durante l'incubazione, allineare gli ovociti orizzontalmente.

Dopo che sono passati cinque minuti. Usa l'ago per enucleazione per posizionare un ovocita davanti all'ago di contenimento. Utilizzando un micro iniettore, applicare un vuoto per fissare l'ovocita all'ago porta micropipetta.

Successivamente, utilizzando l'ago di enucleazione, ruotare l'ovocita fino a quando il complesso del fuso cromosomico, che appare ipertrasparente rispetto al plasma operatorio, si trova nella posizione delle tre, avviare un impulso pizo premendo il pedale per penetrare la zno lucita. Un impulso pizo è un impulso meccanico che viaggia longitudinalmente e fa vibrare la punta dell'ago di nucleazione. Le vibrazioni della punta aiutano a perforare la zop lucita.

Una volta attraversata la zona palita, posizionare l'apertura dell'ago di nucleazione adiacente al fuso della metafase due e applicare il vuoto. Il complesso del fuso cromosomico si sposterà lentamente nell'ago. Una volta rimosso l'ago, la membrana dovrebbe sigillarsi da sola.

Infine, utilizzando una pipetta orale, trasferire nuovamente i citi enucleati nelle gocce K-S-O-M-A-A. Quindi, utilizzando la stessa pipetta, lavarli trasferendoli da una goccia all'altra di KSOM AA Per eseguire il trasferimento nucleare, scambiare l'ago di enucleazione da sette micrometri sul micro manipolatore con un ago di trasferimento nucleare da quattro a cinque micrometri. Lavare l'ago con PVP come prima.

Posizionare le otto cellule T positive CD isolate in precedenza in una goccia di PVP sulla piastra S-C-N-D-A. Mescolare bene e incubare per almeno 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire da 10 a 30 citi ENUCLEATI in una goccia di HCZB con 2,5 microgrammi per millilitro.

Cyto B sulla S ct. Una piastra incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, utilizzare l'ago di trasferimento nucleare per allineare i citi orizzontalmente utilizzando l'ago per iniezione.

Prelevare una cellula cedo-ceo-positiva dal terreno PVP e aspirarla dentro e fuori fino a quando la membrana esterna non si è rotta. Se necessario, applicare un impulso pizo frammenti della membrana e il citosol dovrebbe essere visibile. Aspirare il nucleo nell'ago.

Quindi continua a raccogliere i nuclei fino a quando non sono da 10 a 30. Quindi, passa alla goccia contenente i citi enucleati allineati. Applicare il vuoto per fissare un ovocita all'ago di tenuta.

Quindi posizionare l'ago di trasferimento nucleare NU adiacente alla zop lucita con i nuclei orientati lontano dall'apertura. Applicare pizo pulse fino a quando l'ago non ha attraversato la zop lucita. Spingere il micromanipolatore per spostare con cautela un nucleo sulla punta dell'ago.

Spingi l'ago nell'ovocita fino a quando la punta dell'ago non si trova a due terzi dell'interno. Applicare una piccola pressione negativa in modo che una piccola parte della membrana dell'ovocita sia nell'ago. Il passo successivo è molto critico.

Poiché è l'unico momento in cui l'ovocita è effettivamente aperto. Applicare un singolo impulso ZO. Quindi applicare una pressione positiva per spingere il nucleo fuori dall'ago.

Tira indietro con cautela l'ago in modo che la punta sia a circa un terzo dell'ovocita, quindi applica una pressione negativa e continua a tirare indietro l'ago. Per sigillare l'ovocita. Ripeti questo passaggio con ogni ovocita.

Dopo che tutti gli ovociti hanno ricevuto un nucleo, trasferirli nella capsula di Petri e lavarli trasferendoli da una goccia all'altra di KS OM AA media incubare a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Dopo l'incubazione, trasferire gli embrioni SCN T in gocce di terreno di attivazione privo di calcio contenenti cloruro di stronzio. Il cloruro di stronzio attiva l'ovocita inducendo le oscillazioni del calcio che si verificherebbero in modo simile durante la fecondazione.

Incubare per sei ore. Se lo si desidera, ADD TSA, che è un inibitore aspecifico dell'istone diacetil assis ai mezzi di attivazione Al fine di migliorare l'efficienza dopo l'attivazione, esaminare gli embrioni al microscopio invertito per determinare la quantità di pseudo pronuclei o embrioni SCNT positivi per PPN. Il PPN può essere identificato in base al suo aspetto.

Sembrano uova. Lato soleggiato lavaggio e cultura. Gli embrioni e le gocce K-S-O-M-A-A per tre giorni e mezzo a 37 gradi Celsius fino a raggiungere la fase di assistenza all'esplosione.

All'inizio, dovresti concentrarti sull'esecuzione corretta delle procedure che ti abbiamo appena mostrato per la nucleazione e il trasferimento nucleare NU. Una volta che hai imparato queste tecniche, le seguenti procedure sono più facili da gestire Le cellule staminali embrionali o ES utilizzate. Qui sono stati derivati utilizzando tecniche standard.

Questi devono essere preparati il giorno dell'iniezione blasto-assistita, tre giorni e mezzo dopo il cotus. Preparare il coperchio di una capsula batterica sterile preparando gocce contenenti PVP e HCZP. Quindi preparare un ago per iniezione da 15 micrometri per il polso piso come prima.

Quindi, posizionare l'ago di iniezione nel micromanipolatore e lavarlo con trasferimento PVP. Da 10 a 30 esplosioni assiste in una goccia di HCZB. Quindi inserire da cinque a 50 microlitri della sospensione ESL in un'altra goccia di HCZB.

Dovrebbero esserci abbastanza cellule ES in modo che possano essere facilmente raccolte, ma non dovrebbero essere affollate. Quindi, prelevare da 30 a 100 cellule ES con l'ago per iniezione. Spostati verso la caduta con l'esplosione assistita.

Allineare la sabbiatura assistita orizzontalmente e fissarne una con l'ago di tenuta applicando il vuoto. Utilizzare l'ago per iniezione per ruotare l'assistenza dell'esplosione fino a quando la massa cellulare interna non si trova a ore nove. Posizionare l'ago per iniezione a ore tre.

Assicurarsi che non vi siano cellule ES sulla punta dell'ago e applicare un impulso piso fino a quando l'ago per iniezione penetra attraverso la zop lucita e la tripletta nel sigillo blastico. Rilascia da cinque a 15 cellule ES in modo che aderiscano alla massa cellulare interna. Continuare fino a quando tutta l'assistenza esplosiva non è stata iniettata al termine delle iniezioni.

Lavato due volte in K-S-O-M-A-A e procedere al trasferimento chirurgico dell'embrione in luogo di pseudo femmine gravide e anestetizzato topo ricevente femmina pseudo incinta nell'area chirurgica. Utilizzando un rasoio elettrico, rimuovere i peli dal quadrante in basso a destra. Disinfettare l'area utilizzando una soluzione a base di iodio e etanolo al 70% al microscopio da dissezione.

Usa le forbici per aprire la pelle, quindi posiziona le forbici chiuse tra la pelle e il peritoneo e aprile per separare il peritoneo dalla pelle. Individua l'ovaio attraverso il peritoneo, che dovrebbe apparire come una macchia rossa. Quindi usa le forbici per aprire il peritoneo in quella regione.

Usa una pinza per afferrare con cura l'UCT o il grasso circostante ed estrai l'utero usando un capillare collegato a una pipetta orale. Raccogli un gruppo di circa 10 assistenze per l'esplosione che tengono l'ovidotto e l'utero con una pinza. Usa un ago per praticare un piccolo foro nell'utero.

Quindi inserire il capillare con l'assistenza blastica nel lume dell'utero e rilasciarli. Spingi l'utero nella cavità addominale. Individua i bordi del peritoneo e chiudilo con alcuni punti.

Chiudi la pelle del mouse con alcune graffette. Somministrare antidolorifici per via sottocutanea. Quindi trasferisci nuovamente il mouse nella sua gabbia sotto una lampada riscaldante.

Monitora la respirazione del topo fino a quando non si sveglia. Dopo enucleazione e trasferimento nucleare di cellule somatiche. Circa il 70% degli embrioni era positivo per gli pseudo pronuclei.

Come mostrato in questa figura. Il trattamento con TSA per sei o 10 ore non ha avuto alcun effetto. Dopo tre giorni e mezzo di coltura, dal 5 al 10% degli embrioni si è sviluppato in blast assist.

Ancora una volta, l'aggiunta della TSA non ha avuto alcun effetto sul tasso di sviluppo dell'assistenza all'esplosione. L'assistenza blastica SCNT è stata quindi utilizzata per derivare cellule staminali embrionali. La TSA ha migliorato significativamente la velocità con cui le ESL sono state derivate dall'assistenza all'esplosione.

Le cellule S-C-N-T-E-S vengono utilizzate per generare topi chimerici. Il sangue viene prelevato da questi topi e analizzato per la presenza di cellule T specifiche utilizzando l'analisi dei fatti come mostrato qui. Quando il sangue viene colorato con anticorpi anti CDA e tetramero specifico, è possibile identificare una popolazione doppiamente positiva.

Indicando che la cellula del donatore utilizzata per SCNT era di corretta specificità. Ti ho appena mostrato come eseguire il trasferimento LU con cellule somatiche, le iniezioni assistite da blast e il trasferimento di embrioni. Il punto più importante da considerare è la purezza delle cellule T o delle cellule B.

Una volta che hai imparato come eseguire il trasferimento somatico e i tuoi embrioni sono in fase di esplosione, puoi scegliere tra trasferirli direttamente in femmine pseudo gravide o usarli per derivare cellule staminali embrionali e generare topi chimerici.