Name: Imaging verticale di Drosophila Embrioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Impara un protocollo di montaggio per immagini verticali di embrioni di Drosophila con microscopia confocale. Questo metodo consente misurazioni precise delle dimensioni e quantificazione dell'espressione genica.

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Gli autori sono particolarmente in debito con Deborah Harris e Danielle MacKay. Il supporto per questo lavoro è stato fornito dal Dipartimento di Biologia e il Collegio di Arti e Scienze di CWRU, e in base al numero 52005866 HHMI concedere per il supporto della formazione universitaria nelle scienze biologiche.

1. Metodologia di imaging <ol><li> Melt glicerina gelatina in un bagno d'acqua ° 55 ° C per 20-30 minuti fino a quando diventa un liquido omogeneo. Ricciolo, ma non agitare la bottiglia per evitare la formazione di bolle. </li><li> Mentre la gelatina si scioglie, applicare un sottile strato di glicerolo con un Kimwipe su un vetrino pulito (opzionale). </li><li> Pipettare 1 a 1,5 ml di glicerina gelatina sciolta con un P1000 punta tagliata della pipetta sulla superficie del vetrino per creare un sottile strato prima. Pipettare con attenzione per evitare bolle. </li><li> Lasciate che la gelatina solidificare per 5 minuti su una superficie orizzontale, poi posto la diapositiva a -20 ° C per 5 minuti e procedere con l'allineamento degli embrioni. In alternativa, coprire il vetrino con pellicola trasparente e mettetelo a 4 ° C per un massimo di 5 giorni. </li><li> Pipettare una piccola goccia di embrioni macchiato nel 70% glicerolo / PBS o altri mezzi di montaggio Antifade glicerolo-based (ad es Slowfade o Vectashield) sul lato del letto gelatina. </li><li> Iniziare pre-allineamento degli embrioni da parte individualmente di trasferirli dal menù alla superficie gelatina. Trasferirli usando un ago ipodermico inclinato, usando il lato inclinato come un cucchiaio. </li><li> Circa posto gli embrioni lungo 2-3 colonne. Se un embrione si blocca in dell'ago, questo aggiungete la goccia contenente gli embrioni altri per rilasciarlo. Non perdere tempo con cura allineando a questo punto. Lascia un pò di spazio tra le colonne. </li><li> Allineare gli embrioni facendo scorrere orizzontalmente sul supporto gelatina con l'ausilio dell'ago ipodermico. Facendo scorrere, orientare le teste e le code nella stessa direzione. Rendili parallele tra loro lungo la colonna. Rimuovere l'eccesso di glicerolo PBS lasciato come una scia con un pezzo di Kimiwipe contorto. Nota: glicerolo eccesso causerà embrioni di essere vagamente racchiusi all'interno di gel, con conseguente separazione dei due strati di gelatina, il che rende difficile da tagliare e montare. Al contrario, la rimozione di glicerolo troppo si secca e appiattire embrioni. </li><li> Utilizzare una punta di giallo tagliato a diffondere un sottile strato di gelatina negli embrioni (50-150 microlitri, a seconda di quanti erano allineati). </li><li> Porre il vetrino in freezer -20 ° C per 10-20 minuti o conservarlo a 4 ° C per una notte. Assicurarsi che la gelatina è completamente rigido prima del taglio. In caso contrario, il blocco degli embrioni sarà molto difficile da accise. I migliori risultati per il taglio sono ottenuti il ​​giorno successivo. </li><li> In un ambito di dissezione, usare una lama di rasoio per tagliare completamente attraverso la gelatina su entrambi i lati degli embrioni allineate. Tenere la lama di rasoio in un angolo di 90 ° di effettuare tagli diritti. I tagli dovrebbero essere molto vicino ai poli anteriore e posteriore degli embrioni per evitare eccesso di gelatina che può ostacolare l'imaging. </li><li> Aggiungere 100-200 ml di freddo PBT (4 ° C, PBS +0,1% Tween 20) accanto ai tagli e con attenzione raschiare la gelatina tra embrioni con una spatola. Nota: Il detersivo in PBT aiuta la rimozione della gelatina dalla diapositiva senza danneggiare gli embrioni. </li><li> Utilizzando un ago, il trasferimento del blocco di gelatina con embrioni incorporato a un vetrino pulito per il taglio ulteriore. Tagliare i blocchi più piccoli con embrioni 5-7. Usa PBT di muoversi facilmente intorno al blocco di gelatina. In alternativa, posizionare il blocco su una superficie di vetro asciutta per farla attaccare al vetro, che crea una maggiore stabilità proprio per tagliare la gelatina, se necessario. </li><li> Raddrizzarsi gli embrioni incorporato nel gelatina con l'aiuto di una lama di un rasoio e un ago. Per la visualizzazione al microscopio, procedere con uno dei due passaggi riportati di seguito, a seconda del tipo di microscopio stare in uso. </li><li> Microscopio invertito: luogo finito blocchi embrione su un vetrino lungo, con gli embrioni in posizione verticale. Assicurarsi che il lato dell'embrione con la minor quantità di gelatina sarà a più stretto contatto con obiettivo. </li><li> Microscopio verticale: fare due pile con quattro # 1 coprioggetto incollato con colla da utilizzare come "supporto" e posizionare il blocco embrione in glicerolo tra i "supporti". Colmare il pile con un coprioggetto lungo. </li><li> Per l'analisi confocale, controllare la distanza di lavoro degli obiettivi da utilizzare per sapere se è possibile immagine tutto il percorso attraverso l'embrione o solo parzialmente. Per esempio, D. embrioni melanogaster hanno ~ 0,55 millimetri di lunghezza e possono essere interamente ripreso con un Zeiss 20x Plan-Apo o un 40x LD neo-Fluor obiettivo. Il sito contiene informazioni sui seguenti obiettivi Zeiss disponibili e vi dà la possibilità di ricercare gli obiettivi in ​​base alle distanze di lavoro: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. Rappresentante Risultati Perché gli embrioni sono rimasti intatti, questo metodo può essere utilizzato per effettuare misurazioni precise delle dimensioni degli embrioni e distanze tra gli schemi di espressione genica. Nella Figura 1, ci mostrano una embrioni Blastoderm fase colorati con il nucleare macchia DAPI (blu), anti-dorsale delle proteine ​​(rosso), mRNA SOG (giallo) e mRNA sna (verde). Proces morfologicases, come invaginazione del mesoderma (Figura 2A, B) e la migrazione di cellule mesodermiche (Figura 3 e 4) possono anche essere visualizzati utilizzando questo metodo. Z-posizioni diverse lungo l'asse DV può essere ottenuto cambiando il piano focale, come mostrato nelle Figure 2-4. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Verticale fetta ottica di un embrione intatto in fase Blastoderm. Colorazione doppia per mRNA e proteine. MRNA bersaglio per le sonde in situ (SOG e SNA) e di proteine ​​colorate con l'anticorpo primario (anti-dorsali) sono indicati in figura. DAPI è stato usato per etichettare i nuclei. Si noti che l'espressione di SOG e SNA si trovano nel citoplasma apicale, mentre l'espressione della dorsale è nucleare. Segnali forti dalle trascrizioni sog nascente che si trovano nei nuclei può essere visto anche in questo ingrandimento. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Immagine verticale di un embrione intatto gastrulating. Sonde mRNA usato e loro rispettivi colori sono indicate in figura. A) Si noti che in questa fase, tre geni colorati con lo stesso fluoro (sna, SOG e DPP, in verde), sono espressi in domini separati spazialmente. Il mesoderma invaginating esprime sna, lo strato di neuroblasti esprime ind e l'ectoderma esprime dpp, mentre l'espressione sog è ancora presente nelle regioni ventrale del sistema nervoso. B) In un piano più profondo confocale dell'embrione stesso, si nota la base del mesoderma invaginating esprime fortemente sna, ma la sua regione apicale esprime livelli più bassi. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Immagine verticale di un embrione intatto con la band di germe esteso sog RNA (giallo);. Lumaca, ind e mRNA DPP (verde), proteine ​​dorsali (rosso). I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). A) sul piano focale vicino alla testa dell'embrione. B) Un altro piano focale nella regione del tronco dell'embrione stesso. Massa nota di cellule mesodermiche prima della migrazione laterale (confronta con Figura 4) aderente alla linea mediana ventrale su entrambi i lati di un germe-band embrione esteso. Neuroblasti delaminazioni sono etichettati in verde (ind e SNA). <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Immagine verticale di un embrione intatto durante l'estensione di germe di banda sog RNA (giallo);. Lumaca, ind e mRNA DPP (verde), proteine ​​dorsali (rosso). A) Si noti la neuroblasti delaminazioni dal epitelio (freccia), macchiato sia per ind e SNA in questa fase (verde). Si noti anche l'espressione ristretto di SOG alla linea mediana ventrale (giallo). Espressione di DPP in questa fase può essere visto facce laterali dell'embrione (asterisco). B) sezione ottica nell'embrione stesso mostrato in A verso la fine della lunghezza dell'embrione, che corrisponde alla metà posteriore regione. Le cellule della linea mediana ventrale sono macchiati di sog.

<ol><li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li>
<li>Grβhans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li>
<li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li>
<li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-on+imaging%3A+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li>
<li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22The+Bryologist%22%5BJournal%5D)">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li>
<li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Prendendo immagini sezione di embrioni di Drosophila può essere impegnativo, perché richiede sia una dissezione accurata mano di fette di 2 o l&#39;uso dei mezzi di comunicazione embedded per l&#39;elaborazione microtomo, che di solito è dannoso per colorazioni fluorescenti. In alternativa, Z-stack fatto in un microscopio confocale può essere usato per fare la ricostruzione 3D della sezione immagini. Tuttavia, è tempo di fare varie fette sottili confocale per una accurata ricostruzione 3D e photobleaching diventa problematico. Un&#39;altra preoccupazione quando gli embrioni di imaging che sono montati longitudinalmente è la dispersione della luce che si verifica quando si raggiunge più sezioni dell&#39;embrione, che complica anche le misurazioni precise dei segnali fluorescenti a fini di quantificazione dei livelli di espressione della proteina o di mRNA 1. Anche con un microscopio a due fotoni confocale, dispersione della luce è ancora una preoccupazione a causa della opacità del materiale tuorlo al centro dell&#39;embrione, che fa selezione di supporti di montaggio per la massima trasparenza del campione a essere limitata. Per aggirare questi problemi, una nuova tecnica di imaging chiamata &quot;End-on&quot; degli embrioni posizionamento in verticale è stato recentemente sviluppato per l&#39;immagine sia dal vivo che i campioni fisso 4. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per gli embrioni montate verticalmente che permette una semplice preparazione e la visualizzazione di embrioni fisso o tessuti di qualsiasi dimensione e forma che si sono macchiati con più sonde in situ 3. Il nostro metodo consiste nell&#39;utilizzare un supporto di montaggio con consistenza gelatinosa che viene usato per racchiudere gli embrioni allineati al suo interno. Blocchi tagliati di questo mezzo di montaggio contenente gli embrioni incorporato può essere posizionato in posizione verticale prima immagine in qualsiasi tipo di microscopio confocale. Integrando gli embrioni in gelatina e il posizionamento in verticale, siamo in grado di prendere orizzontale sezioni usando la microscopia confocale, in cui vengono presentati cellule lungo il dorso-ventrale asse dell&#39;embrione contemporaneamente. Questo è un miglioramento significativo ai fini quantificazione perché i problemi di dispersione della luce e photobleaching di coloranti fluorescenti che si verifica in convenzionale Z-stack ricostruzione di embrioni montato longitudinalmente sono ora eliminati. Così, la quantificazione dei livelli di espressione del gene o della proteina lungo l&#39;asse dorso-ventrale è preciso, dal momento che le cellule situato di fronte dorso-ventrale posizioni sono esposte nello stesso momento e nello stesso tempo confocale Z-posizione. Inoltre, il metodo descritto permette di ottenere una completa immagine 2-D in tutto il dorso-ventrale asse da un 3-D embrione senza l&#39;utilizzo di complessi metodi computazionali svolgimento di visualizzare le cellule in posizioni diverse lungo l&#39;asse DV 6. Alcuni dei passaggi critici includere la rimozione glicerolo in eccesso dopo l&#39;allineamento degli embrioni, per evitare di dividere tra i due strati di gelatina. Tuttavia, se il campione è troppo disidratato, l&#39;immagine risultante sarà deformi e hanno una morfologia corretta. Inoltre, se il mezzo gelatina intorno l&#39;embrione viene tagliato con un angolo piuttosto che direttamente, l&#39;immagine risultante può apparire meno rotondo e più in forma ovulare, a causa di un non corretto posizionamento degli embrioni a un angolo di 90 gradi. Infine, se la gelatina non viene tagliato strettamente sufficiente per l&#39;embrione sulle estremità anteriore / posteriore, non è possibile ottenere una immagine corretta distanza di lavoro, perché l&#39;obiettivo sarebbe stato utilizzato principalmente per concentrarsi nella gelatina e non l&#39;embrione. Un altro passo importante che può essere necessaria quando l&#39;imaging embrione gastrulating fine è quello di ordinare con attenzione le fasi di interesse nell&#39;ambito di applicazione prima di allineare loro. Di solito, gli embrioni sono messo in scena in base alle caratteristiche morfologiche che possono essere più facilmente riconoscibile quando è in posizione longitudinale. Tra le modifiche alternativi che possono essere fatte con questo metodo è quello di includere un anti-fade reagente (ad esempio p-fenilendiammina o PPD) nel secondo strato di gelatina per aiutare a proteggere contro photobleaching di coloranti fluorescenti.

<table><tbody><tr><td>Mezzo di montaggio in gelatina glicerina</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17998-10</td><td>Contiene una bassa concentrazione di fenolo come conservante e deve essere utilizzato sotto cappa o in un'area ben ventilata. La ricetta per la preparazione del mezzo è descritta in Zander, 1997.</td></tr><tr><td>Confocale Zeiss LSM 700</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Sono stati utilizzati i seguenti obiettivi: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55 mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 olio (WD 0.21 mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9 mm).</td></tr><tr><td>Soluzione salina fosfato con 0,1% di Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini in vetro per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Coprioggetti in vetro</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72204-02</td><td>Dimensione 1 &amp;#189; (specifico per gli obiettivi utilizzati in questo lavoro).</td></tr><tr><td>Coprioggetti in vetro (per la realizzazione di supporti)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-10</td><td>Utilizzare quattro coprioggetti incollati con colla cianoacrilica.</td></tr><tr><td>Microscopio per dissezione</td><td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>Lama da rasatura</td><td></td><td></td><td>Lame industriali in acciaio monolame con dorso in acciaio</td></tr><tr><td>Spátola</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>Aghi ipodermici</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482610</td><td>Calibro 26</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Labnet International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging verticale di drosophila embrioni

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Alcuni noti gradienti morfogenetici e movimenti cellulari si verificano lungo l&#39;asse dorsale / ventrale della<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrione. Tuttavia, le attuali tecniche utilizzate per visualizzare tali processi sono piuttosto limitate. Il protocollo che segue descrive una nuova tecnica per il montaggio fisso ed etichettato<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni per la visualizzazione coronale con imaging confocale. Questo metodo consiste di incorporamento embrioni tra due strati di glicerina mezzi gelatina di montaggio, e di imaging strisce di gelatina in posizione eretta. Il primo passo per sandwiching gli embrioni è di fare un sottile letto di glicerina gelatina in una diapositiva. Successivamente, gli embrioni vengono accuratamente allineati su questa superficie e coperto con un secondo strato di gelatina. Dopo il secondo strato è solidificato, strisce di gelatina vengono tagliate e capovolto in posizione verticale per l&#39;imaging. Alternative sono descritte per la visualizzazione degli embrioni a seconda del tipo di stand microscopio da utilizzare. Dal momento che tutte le cellule lungo l&#39;asse dorso-ventrale sono esposte all&#39;interno di un singolo confocale Z-plane, il nostro metodo permette misurazioni precise e il confronto dei segnali fluorescenti senza photobleaching o dispersione della luce comune a ricostruzioni 3D di embrioni montato longitudinalmente.

Qui vi presentiamo un protocollo di montaggio per macchiato<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni in posizione verticale che permette l&#39;imaging di sezioni trasversali usando la microscopia confocale.

Imaging verticale di Drosophila Embrioni

Diversi noti gradienti morfogenetici e movimenti cellulari avvengono lungo l'asse dorsale/ventrale dell'embrione di Drosophila. Tuttavia, l'attuale...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è ottenere immagini in vista coronale di embrioni di oph integri mediante microscopia confocale, che possano essere utilizzate per misurare con precisione le dimensioni dell'embrione e quantificare i livelli di espressione di proteine e RNA. Questo risultato si ottiene utilizzando un mezzo di montaggio di consistenza gelatinosa per racchiudere gli embrioni al suo interno e posizionarli in posizione verticale. Come primo passo.Gli embrioni vengono allineati su uno strato sottile di gelatina glicerica e quindi ricoperti con un secondo strato di questo mezzo. Successivamente, il mezzo di montaggio contenente gli embrioni viene tagliato in blocchi, che possono essere capovolti verticalmente per essere trattenuti. Gli embrioni vengono posizionati in modo da ottenere risultati di imaging che mostrano immagini di sezione trasversale visualizzate con qualsiasi tipo di microscopio confocale.Ciao, mi chiamo Milu. Sono uno studente laureato presso il Meso Lab del dipartimento di biologia della Case Western Reserve University. Oggi illustreremo un protocollo di montaggio per l'acquisizione di immagini di embrioni PHI in posizione dorsale utilizzando un microscopio confocale.Abbiamo sviluppato questo metodo durante il laboratorio del corso di biologia dello sviluppo qui alla Case in collaborazione con il dottor. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la tecnica di imaging Endon sviluppata dal Laboratorio Mindin, è che consente una preparazione e una visualizzazione semplici di embrioni fissati o di tessuti di qualsiasi dimensione e forma. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo avuto la necessità di visualizzare sezioni trasversali di embrioni molto piccoli di altre specie di gesso, che sarebbe stato molto difficile tagliare manualmente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo della biologia dello sviluppo permettendo quantificazioni precise dell'espressione genica e dei livelli proteici lungo l'asse dorso-ventrale.Tipicamente, gli embrioni vengono montati longitudinalmente. Sebbene sia possibile ottenere ricostruzioni di sezioni trasversali con Zack, spesso si verifica un problema di fotobleaching e di dispersione della luce fluorescente degli occhi, ed è molto dispendioso in termini di tempo. La nostra tecnica riduce al minimo questi problemi perché le immagini di sezioni trasversali degli embrioni vengono visualizzate lungo un singolo punto confocale.Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare alcune difficoltà nel tagliare i blocchi di gelatina glicerata in prossimità dell'apice degli embrioni. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché richiede una manipolazione accurata. Oggi abbiamo una dimostrazione realizzata dai nostri studenti, Catherine Chen e Catty, per preparare embrioni di drosophila per l'immagine in posizione eretta.Sciogliere prima la gelatina di glicerina in un bagno d'acqua a 55 gradi Celsius per 20-30 minuti, fino a quando non diventa un liquido omogeneo vorticoso. Non agitare il flacone per evitare la formazione di bolle. Utilizzando una punta pipetta P 1000 tagliata, prelevare con attenzione un millilitro di gelatina di glicerina fusa e depositarlo sul vetrino.Per creare uno strato sottile e uniforme privo di bolle d'aria, lasciare solidificare la gelatina per cinque minuti su una superficie orizzontale. Successivamente, posizionare il vetrino in un congelatore a meno 20 gradi Celsius per cinque minuti. In alternativa, coprire il vetrino con della pellicola trasparente e conservarlo a quattro gradi Celsius per un massimo di cinque giorni.Una volta che il primo strato di gelatina si è solidificato, portare il vetrino al microscopio ed eseguire l'allineamento dell'embrione. Pipettare una piccola quantità di embrioni colorati e glicerolo al 70% PBS sul lato del primo strato di gelatina. Al microscopio, allineare gli embrioni uno accanto all'altro lungo tre o quattro colonne per vetrino.Usare un ago ipodermico per raccoglierli utilizzando il lato inclinato dell'ago, come se fosse un cucchiaio. Orientare con attenzione le teste di tutti gli embrioni nella stessa direzione, facendoli scivolare orizzontalmente sul mezzo gelatinoso con l'aiuto dell'ago.La configurazione finale degli embrioni allineati sarà simile a quella descritta per l'iniezione di DNA. Utilizzando un pezzo di Kimwipe arrotolato, rimuovere l'eccesso di PBS glicerolo dagli embrioni. Pipettare con attenzione da 50 a 300 microlitri di gelatina di glicerina fusa sopra gli embrioni, in base al numero di embrioni, per formare un secondo strato di gelatina.Infine, raffreddare il vetrino a meno 20 gradi Celsius per cinque-dieci minuti oppure conservarlo a quattro gradi Celsius durante la notte. Per rimuovere gli embrioni inclusi nel glicerolo dal vetrino per l'analisi al microscopio stereoscopico, utilizzare una lametta per tagliare il gel in prossimità dei lati anteriore e posteriore degli embrioni allineati. Tenere la lametta a un angolo di 90 gradi.Per effettuare tagli dritti, aggiungere da 100 a 200 microlitri di PBT freddo accanto ai tagli. Rimuovere con attenzione la gelatina vicino agli embrioni. Utilizzando una spatola, il PBT aiuta a staccare il blocco di embrioni.Trasferire il blocco su un vetrino asciutto per ulteriori tagli. In primo luogo, tagliare blocchi più piccoli contenenti cinque a sette embrioni ciascuno. In secondo luogo, rimuovere l'eccesso di gelatina glicerina che potrebbe interferire con l'acquisizione delle immagini.Infine, capovolgere gli embrioni inclusi in posizione eretta aiutandosi con una lametta e un ago. Per visualizzare gli embrioni di drosophila mediante microscopio confocale invertito, posizionare il blocco di gelatina contenente gli embrioni su un'oggettino. Assicurarsi che la parte dell'embrione con la minore quantità di gelatina sia a contatto più stretto con l'obiettivo.Se si utilizza un microscopio verticale per l'acquisizione delle immagini, preparare quattro pile di colla supra. Prima, posizionare coprioggetti da usare come supporti e collocare il blocco embrionale nel glicerolo tra i supporti. Colmare le pile utilizzando un coprioggetto più lungo per l'analisi al microscopio confocale.Posizionare il campione sul palchetto del microscopio. Verificare la distanza di lavoro degli obiettivi da utilizzare per determinare se è possibile acquisire immagini attraverso l'intero embrione o solo parzialmente; configurare quindi la strumentazione confocale sul computer per iniziare l'acquisizione come mostrato qui. Se il protocollo viene eseguito correttamente, è possibile osservare immagini di sezioni trasversali di embrioni con morfologia intatta, poiché gli embrioni vengono lasciati integri.Questo metodo può essere utilizzato per effettuare misurazioni precise delle dimensioni degli embrioni e dei livelli di espressione genica lungo l'asse dorso-ventrale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30-45 minuti. È importante rimuovere l'eccesso di glicerolo prima di versare il secondo strato di gelatina di glicerina sugli embrioni.In caso contrario, i due strati potrebbero separarsi e rendere il taglio più difficile. Inoltre, è necessario verificare la distanza di lavoro delle lenti obiettive in uso per assicurarsi di poter immaginare l'intero embrione o solo una parte di esso, poiché la distanza di lavoro limita l'estensione dell'immagine ottenibile. Assicurarsi di tagliare la gelatina il più vicino possibile al lato dell'embrione che verrà posizionato verso l'obiettivo.In caso contrario, otterrete immagini soltanto della gelatina anziché degli embrioni. Dopo aver visto questo video, speriamo che abbiate acquisito una buona comprensione di come ottenere immagini trasversali degli embrioni di Joseph. Grazie per averci seguito e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Questo lavoro descrive un protocollo semi-alto-velocità che consente l'imaging simultaneo 3D time-lapse di embriogenesi in 80-100 C. elegans embrioni in un singolo periodo notturno. Inoltre, sono inclusi strumenti di elaborazione e visualizzazione delle immagini per semplificare l'analisi dei dati. La combinazione di questi metodi con ceppi di reporter personalizzati consente un monitoraggio dettagliato dell'embriogenesi.

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

Questo protocollo descrive la marcatura e l'iniezione di fluorescenza personalizzata basata su anticorpi negli embrioni precoci di Drosophila per consentire l'imaging dal vivo di proteine a bassa abbondanza o modifiche post-traduzionali che sono difficili da rilevare utilizzando i tradizionali approcci GFP/mCherry-tag.

Visualizzazione di proteine a bassa abbondanza e modificazioni post-traduzionali in embrioni di Drosophila viventi tramite iniezione di anticorpi fluorescenti

Questi protocolli delineano come caratterizzare l'organizzazione e la funzione di occluso delle giunzioni del setto piegato nell'epitelio embrionale di Drosophila di controllo e mutante.

Immunocolorazione e esperimenti di penetrazione del colorante per definire le proteine di giunzione settata piegate core nell'epitelio embrionale di Drosophila

Impara un protocollo di montaggio per immagini verticali di embrioni di Drosophila con microscopia confocale. Questo metodo consente misurazioni precise delle dimensioni e quantificazione dell'espressione genica.

Imaging verticale di Drosophila Embrioni

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