Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

I canali del potassio rettificanti inwardly regolati dalle proteine G, o grk, sono importanti per regolare l'eccitabilità dei neuroni. I gks possono essere attivati sia da recettori accoppiati a proteine G (GPCRs), come il recettore muscarinico M2R, sia dall'alcol, al fine di studiare gli effetti di mutazioni nel sito di legame dell'alcol sul gerk. Dopo l'attivazione, una mutazione puntiforme viene introdotta nel cDNA del grk mediante mutagenesi direzionata al sito; i costrutti purificati di gerk sono trasfettati, insieme a costrutti YFP, in cellule mammifere, e l'efficienza di trasfezione viene valutata mediante imaging di fluorescenza.

L'analisi con tecnica del patch clamp su cellula intera viene quindi eseguita per confrontare l'attivazione dipendente dall'alcol e dalle proteine G. Questa dimostrazione sperimentale visiva vi fornirà informazioni essenziali su come studiare la funzione dei canali LY. Oggi esamineremo una domanda relativa al modo in cui l'alcol attiva i canali di gruppo.

La tecnica di neoformazione mirata qui mostrata può fornire informazioni sul funzionamento dei canali ionici. Questa tecnica può essere applicata anche ad altri sistemi in cui è noto che una mutazione in un gene causi una malattia umana. Queste sono dimostrazioni della tecnica di patch-clamp su cellule calde, la cui padronanza è fondamentale poiché comprende numerosi passaggi che richiedono precisione, un'adeguata compensazione elettronica e pratica per generare dati utilizzabili.

Il DNA utilizzato per la trasfezione in questo protocollo viene preparato come segue. In primo luogo, il subunità GRK, il DNA ottenuto dalla PCR viene clonato direttamente nel plasmide di espressione mammifero. Vengono introdotte mutazioni puntuali nel plasmide pCDNA 3.1 utilizzando primer opportunamente progettati insieme al kit di mutagenesi direzionata QuickChange XL a due siti.

Utilizzando questo sistema, viene eseguita una PCR in cui l'intero plasmide viene replicato e vengono introdotte mutazioni puntiformi codificate dai primer. Dopo la PCR, i plasmidi replicati vengono digeriti con l'enzima di restrizione DPN uno e quindi trasformati mediante shock termico in e coli XL 10 gold ultra competent. I batteri trasformati vengono coltivati su piastre di agar LB contenenti ampicillina; i batteri che contengono il plasmide sono resistenti all'ampicillina e formeranno colonie.

Le colonie isolate vengono selezionate e coltivate in colture minime. Vengono eseguiti mini-prep per isolare il DNA plasmidico. Il DNA viene quindi sequenziato per identificare i mutanti correttamente trasformati.

I batteri E. coli vengono coltivati in un lotto più grande e vengono eseguite delle maxi preps per preparare quantità maggiori di DNA plasmidico; piastrare circa 1 × 10⁵ cellule HEC 293 T in ciascuna di due pozzette di una piastra a 12 pozzette, una per il mutante e una per il controllo. Incubare il canale di tipo selvaggio a 37 °C.

Dopo otto a 24 ore, le cellule aderiranno al loro substrato e saranno pronte per la trasfezione. Trasfettare le cellule con lipo 2000 seguendo le istruzioni del produttore, utilizzando 0,2 microgrammi di cDNA del canale, 0,4 microgrammi di cDNA del recettore M2R e 0,04 microgrammi di YFP-cDNA. Per identificare le cellule trasfettate con successo, incubare le cellule per 24 ore.

Trascorso il tempo di incubazione desiderato, posizionare le cellule sul piatto di un microscopio a fluorescenza invertito per determinare l'efficienza di trasfezione. Confrontare le immagini fluorescenti e quelle a contrasto di fase per determinare la percentuale di cellule trasfettate. Rimettere la piastra di coltura nell'incubatrice.

Pulire coprioggetti di vetro da 12 millimetri e conservarli in etanolo fino all'uso. Rimuovere l'etanolo residuo flambéndoli nell'armadio sterile. Posizionare i coprioggetti in una piastra a 24 pozzetti e ricoprirli con 0,2 milligrammi per millilitro.

Poli-d-lisina 24 ore dopo la trasfezione, si trittura con tripsina e si piastrano quattro volte 10 alla tre cellule per pozzetto in quattro-otto pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente coprivetri rivestiti con poli-d-lisina. Incubare per ulteriori 24-48 ore prima di eseguire il patch clamping in modalità whole-cell. Preparare gli elettrodi per il patch utilizzando un tiratore verticale a due stadi e vetro elettrodico di borosilicato.

Il microelettrodo finito dovrebbe idealmente presentare una resistenza compresa tra tre e sette megaohm e non richiedere ulteriori manipolazioni, come la lucidatura termica. Per la tecnica del patch clamping, posizionare un'ogiva con cellule trasfettate in una piastra da 35 millimetri contenente una soluzione esterna con 20 millimolari di potassio o 20 K. Posizionare la piastra sul portacampioni di un microscopio a fluorescenza invertito.

La configurazione di patch clamping utilizzata in questo caso impiega un sistema di perfusione. Questo sistema contiene le soluzioni extracellulari che verranno applicate alle cellule, alimentate per gravità attraverso tubi collegati a un collettore. Ogni soluzione è controllata a distanza mediante una valvola a spillo comandata da un solenoide.

Utilizzare la DIC per mettere a fuoco e individuare le cellule. Passare al filtro YFP per localizzare le cellule positive a YFP. Una volta identificate le cellule positive a YFP, posizionare la punta del sistema di perfusione, cellula neurofluorescente, a 20-30 micron o a due-tre lunghezze cellulari di distanza.

Riempire un elettrodo con soluzione elettrodica interna. Utilizzando una siringa e un ago flessibile, battere delicatamente sull'elettrodo riempito per rimuovere le bolle d'aria dalla punta. Collegare gli elettrodi allo stadio di testa di un amplificatore AXO patch 200 B.

Verificare nuovamente che le impostazioni sull'amplificatore corrispondano a una configurazione. L'interruttore per la cellula intera è beta uguale a uno, e il filtro passa-basso è impostato a 10 chilohertz. Applicare una pressione positiva con la siringa e la pinza per mantenere pulita la punta dell'elettrodo.

Quindi utilizzare un micromanipolatore per posizionare la punta dell'elettrodo nel bagno e spostarsi al di sopra della cellula. Passare l'amplificatore in modalità V track e la manopola del misuratore in V track. Quindi utilizzare il misuratore del potenziale di offset della pipetta sull'amplificatore per azzerare il potenziale della pipetta, portando il voltaggio visualizzato sul misuratore dell'amplificatore a 0,00.

In alternativa, passare alla modalità clamp di tensione sull'amplificatore e selezionare il pulsante del test per applicare un impulso di tensione di prova. L'impulso di tensione rettangolare apparirà nella finestra di test del sigillo del clamp. Regolare l'offset della pipetta sull'amplificatore per portare la corrente di base a zero nanoampere.

Il test di sigillatura mostrerà la resistenza dell'elettrodo, che dovrebbe essere compresa tra tre e sette megaohm. Chiudere quindi la finestra del test di sigillatura. Selezionare acquisisci protocollo aperto nel menu a discesa.

Quindi selezionare un protocollo di tensione salvato. In questo caso, il protocollo selezionato è stato preprogrammato per applicare un singolo passo di tensione a meno 100 millivolt e una rampa fino a più 40 millivolt ogni due secondi. Questo protocollo a rampa consente l'osservazione del potenziale di inversione e della proprietà di rettificazione entrante dei canali GK.

Per i canali ionici attivati dal voltaggio, un gradino rettangolare di voltaggio potrebbe essere più appropriato; utilizzando la regolazione fine del micromanipolatore, avvicinarsi alla cellula, rilasciare la pressione positiva e, dopo aver toccato la superficie cellulare, applicare una leggera pressione negativa. Monitorare l'aumento risultante della resistenza nel test di sigillo. Una volta che la resistenza raggiunge l'ordine dei gigaohm, l'elettrodo si è sigillato sulla membrana.

Questo è definito sigillo giga. Utilizzando una siringa, applicare un impulso di pressione negativa per rompere la membrana e ottenere l'accesso alla cellula. Una volta raggiunta la configurazione a intera cellula, il test del sigillo registrerà ampie correnti capacitive visibili come picchi o transitori all'inizio e alla fine del test.

Test del battito nella guarnizione. Successivamente, fare clic sul pulsante del test della membrana. Nel clamp X, registrare la resistenza di accesso e la resistenza della membrana.

Una capacità della membrana in un quaderno consente di verificare ad occhio l'adeguatezza del fit esponenziale. La capacità della membrana è proporzionale alle dimensioni della cellula e verrà utilizzata per calcolare l'accesso alla densità di corrente. La resistenza e la resistenza della membrana sono utilizzate per valutare se la registrazione sarà soddisfacente per proseguire.

Una buona registrazione avrà una bassa resistenza di accesso. Chiudere ora la finestra del test sulla membrana e fare nuovamente clic sul pulsante del test di sigillo nella finestra del test di sigillo; impostare V out a meno 40 millivolt per compensare la capacità della membrana e la resistenza in serie sull'amplificatore, attivare la modalità whole cell, regolare avanti e indietro il condensatore della cellula intera e la resistenza in serie finché il transitorio non viene minimizzato e la corrente diventa una linea piatta. Se necessario, regolare la capacità della pipetta con la manopola del condensatore rapido sull'amplificatore.

Una compensazione eccessiva o insufficiente lascerà un transitorio di capacità residua. Successivamente, ruotare la manopola della percentuale di predizione al 60-80% e riaggiustare la resistenza di serie della capacità in modalità cellula intera e la capacità rapida secondo necessità, al fine di ottenere una linea piatta nel test di sigillo. Infine, portare la compensazione percentuale a circa il 100% senza far oscillare la cellula, cercando nel contempo di mantenere l'impulso il più lineare possibile mediante ulteriore regolazione dei potenziometri della resistenza di serie della capacità in modalità cellula intera e della capacità rapida.

Dopo aver raggiunto la compensazione della resistenza e della capacità, annotare su un taccuino il valore impostato per la percentuale di resistenza di serie del condensatore dell'amplificatore, la percentuale di compensazione, la previsione e il tempo di ritardo, quindi aprire la valvola della soluzione esterna per la soluzione da bagno di controllo 20 K. Impostare il filtro del vaso passa-basso sull'amplificatore a due chilohertz. Quindi iniziare la registrazione delle correnti cliccando sul pulsante di registrazione nel software.

Cercare la proprietà di rettificazione interna della corrente ger. Questa si manifesta come una corrente interna ampia negativa rispetto al potenziale di inversione del potassio, determinato dall'equazione di Nernst EK, e una corrente esterna ridotta positiva rispetto a ek. Dopo aver registrato una baseline stabile, determinare l'attivazione mediata dai recettori delle correnti applicando la soluzione extracellulare 20 k più carbacolo.

Una volta osservata l'attivazione massima e raggiunto lo stato stazionario della corrente, tornare alla soluzione di bagnetto K e attendere finché non si raggiunge il livello di corrente di base. Successivamente, per studiare l'attivazione delle correnti gert da parte dell'alcol, passare alla soluzione esterna contenente 20 k più 100 millimolare di etanolo e attendere la risposta di picco.

Quindi tornare alla soluzione di risciacquo con 20 K e attendere finché non viene raggiunto il livello di corrente di base. Infine, per determinare le correnti basali di gert, passare alla soluzione con 20 K più 20 K di bario e attendere la risposta in queste condizioni. L'inibizione della corrente gerk dovrebbe essere evidente, risultando più pronunciata a meno 100 millivolt durante tutta la procedura.

Si noti il numero della traccia corrispondente all'applicazione di diverse soluzioni extracellulari. Un singolo file di acquisizione in regime di voltage clamp conterrà tutte le tracce per l'intero esperimento. Per analizzare i dati di GK, utilizzare il software ClampFIT 8.2.

Secondo le istruzioni riportate nel protocollo scritto allegato, sono state ottenute due diverse registrazioni in bulk da cellule HEC 2 9 3 T che esprimono canali GK di tipo selvaggio o mutanti, e analizzate seguendo le indicazioni di questo video, come mostrato qui per il tipo selvaggio GK due. Il pannello a sinistra contiene una finestra con diverse correnti sovrapposte generate dal protocollo di rampa di tensione in presenza di diverse soluzioni. Si noti la rettificazione in ingresso.

Questa è la corrente entrante più grande a -100 millivolt intorno a 50 millisecondi sulla traccia della corrente. La piccola corrente uscente compresa tra 0 e +40 millivolt intorno a 200-260 millisecondi sulla traccia della corrente origina da un canale del potassio endogeno con gate voltaggio-dipendente. Non si tratta della corrente Gert.

Uno viene posizionato sul valore massimo della corrente entrante, e i valori del cursore vengono riportati nel foglio di calcolo. Nel foglio di calcolo si vedono il numero della traccia e la corrente a meno 100 millivolt.

I dati includono la corrente basale, le correnti indotte da carbacholo e quelle evocate dall'alcol, oltre a una corrente inibita dal bario. Allo stesso modo, le correnti durante una rampa di tensione in presenza di diverse soluzioni. Sono mostrate le correnti per il canale mutante L 2 57 w in presenza di 20 k più 100 millimolar etanolo o 20 k più 5 millimolar carbacholo o 20 k più bario.

Si noti la notevole riduzione delle correnti indotte da alcol e carbo-alcol. Questi risultati suggeriscono che questo residuo svolge un ruolo importante nella modulazione dei canali GK da parte dell'alcol e delle subunità g beta gamma. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come costruire una mutazione in un gene e iniziare a studiarne l'effetto sulla funzione del canale mediante tecniche elettrofisiologiche avanzate.

Una volta padroneggiata, questa tecnica di neogenesi diretta può essere eseguita in due o tre giorni e ampliata fino a cinque o più mutazioni. Lo sviluppo di queste tecniche ha aperto la strada ai biofisici dei canali ionici per esplorare le proprietà fondamentali della funzione e della gating dei canali ionici. Inoltre, consentono ai ricercatori di studiare le malattie umane causate da una singola mutazione in un gene di canale ionico.