Name: Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: Impara la mutagenesi sito-specifica e la patch clamp su cellule di mammifero per studiare i canali potassio GRK. Questo metodo elettrofisiologico permette di analizzare gli effetti di mutazioni puntiformi sull'attivazione dei canali ionici.

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Il nostro lavoro è stato reso possibile dal sostegno finanziario McKnight Endowment Fund for Neuroscience (PAS), del National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022; PAS) e un pre-dottorato NIH NRSA borsa di studio per PA (F31AA017042) dal National Institute on Alcohol Abuse e alcolismo. Il GIRK2-L257W mutante è stato fornito dal Dr. Prafulla Aryal. Microscopio a fluorescenza e sponsorizzazioni gentilmente fornito da strumenti Leica.

1. Mutagenesi sito Noi usiamo mammiferi plasmide di espressione pcDNA3.1 codifica di un cDNA per GIRK2 e introdurre una mutazione puntiforme utilizzando Stratagene (Agilent Technologies) QuikChange XL II sito-kit mutagenesi, secondo le istruzioni del produttore. Sequenza primer può essere facilmente generato usando in linea programma di progettazione fondo disponibile all'indirizzo: <a href="https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15">https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15</a> Nota: uso standard Eppendorf provette da 1,5 ml al posto del BD 14 mL descritte nel protocollo. Tuttavia, l'uso di XL10-Gold ultracompetent E. coli pretrattati con β-mercaptoetanolo, 30s tempo shock termico e NZY + (o NZYM +) i media sono fondamentali per la mutagenesi di successo. Se possibile, ingegneria una mutazione ulteriore silenzioso che crea un nuovo sito di restrizione può essere conveniente per lo screening di colonie mutanti sotto. 2. Miniprep, sequenziamento del DNA e Maxiprep 2,1 Qiagen miniprep e sequenziamento. Singole colonie batteriche vengono raccolte e coltivate in brodo LB con ampicillina (AMP). Seguiamo le istruzioni del produttore per la purificazione del cDNA. Un digest restrizione semplice può essere utilizzato confermare il successo della mutazione, se un sito di restrizione è incorporato nel punto 1. Automatizzato sequenziamento del DNA viene fatto fuori sede, ed è essenziale per confermare la presenza della mutazione in cDNA, così come di valutare se ci sono mutazioni indesiderate. Questo passaggio è molto importante. Noi sequenza l'intera sequenza codificante GIRK utilizzando promotore T7 avanti e indietro BGH primer di sequenziamento che fiancheggiano sito clonazione multiplo della pcDNA3.1 plasmide. Nota: è importante controllare con attenzione la sequenza elettroferogramma sufficiente per assicurare la qualità dei dati di sequenziamento. Elettroferogramma di alta qualità è forte, non sovrapponibili, con picchi di rumore di fondo poco. 2,2 Qiagen maxiprep. Seguiamo le istruzioni del produttore. Nota: questo passaggio è incluso nei nostri esperimenti per migliorare la purezza del cDNA, che troviamo è importante per la trasfezione efficiente. 3. Cultura e Transfection delle cellule HEK293T Tutti questi passaggi dovrebbe essere fatto in una cappa sterile coltura di tessuti. 3,1 Colture cellulari Cellule HEK293T sono comodi da usare perché sono facili alla cultura (37 ° C, 5% CO 2 umidificata incubatore), il tempo veloce della replica, ad alta efficienza di trasfezione e sono suscettibili di whole-cell patch-clamp elettrofisiologia. Cellule HEK293T esprimere SV40 antigene T grande che assicura la replicazione del plasmide episomiale pcDNA3.1. HEK293T cellule sono coltivate in condizioni di scarsa glucosio DMEM dei media integrato con L-glutamina e 10% siero bovino fetale (FBS). Per le celle passaging, aggiungere 0,25% tripsina / EDTA per confluenti (90-95%), le cellule HEK293T, attendere che le cellule si staccano dal tessuto piatto, quindi arrestare l'attività enzimatica con l'aggiunta di mezzi freschi contenente FBS /. Piastra ~ 1 x 10 5 cellule / pozzetto in un piatto ben 12 colture cellulari con 1 ml di antibiotico senza mezzi di coltura per bene. (1 x 10 5 cellule è ~ 350 ml di sospensione cellulare ottenuta da confluenti T25 fiasco risospeso con 10 mezzi ml). 3,2 Transfection Dopo 8-24 ore, le cellule HEK aderisce alla plastica e sono pronti per la trasfezione. Trasfezione delle cellule con 0,2 mcg canale cDNA, 0,4 mg M2R recettore cDNA e 0,04 mcg YFP cDNA utilizzando Invitrogen Lipofectamine 2000. Nota: si usa una piccola quantità di YFP cDNA per determinare quali cellule sono transfettate con successo (le cellule verdi probabilmente contengono entrambi i canali GIRK e recettori M2). La concentrazione di cDNA da utilizzare dovranno essere regolati per ciascun clone. 3,3 visualizzazione fluorescenza delle cellule trasfettate. Luogo 12-pozzetti sul palco di un microscopio invertito a fluorescenza, ed esaminare le cellule per l'espressione YFP. Confronta con l'immagine DIC e prendere nota del numero approssimativo di cellule verdi. Questo fornisce una stima della efficienza di trasfezione. 3.4 Preparazione di ben 24 piatti e poli-D-lisina scivola copertina patinata Pulire 12 millimetri scivola copertura in vetro (Warner, CS-12R) agitando per una notte con Radiacwash, seguita da lavaggio con acqua deionizzata e pernottamento agitazione in etanolo al 95%. Conservare il coprioggetto pulito nel 70% di etanolo fino al momento dell'uso. Coperchio scivola posto in piastre di Petri con l'etanolo, fiamme al largo di etanolo con pinze e bruciatore, unluogo d in un pozzetto di una sterile 24 pozzetti. Coprire ogni bene con 250 microlitri di poli-D-lisina (PDL), soluzione [0,2 mg / ml] e lasciare che il coprioggetto sedersi durante la notte immerso in una soluzione PDL sotto cappa sterile. Avvolgere il piatto ben 24 in Parafilm per evitare l'evaporazione. La mattina dopo, aspirare PDL e lavare 2x con acqua sterile. Lasciare aperte le piastre ad asciugare sotto il cofano, poi coprire. I 24 piatti ben rivestiti con la polizza di copertura può essere avvolto in un foglio di alluminio sterile e conservato a temperatura ambiente per settimane. 3,5 cellule HEK293T Placcatura transfettate sulla copertina scivola 24 ore dopo la trasfezione delle cellule, suddivisi in ben 24 piatti (~ 4 X 10 3 cellule / pozzetto) contenente copertura in vetro scivola rivestito con poli-D-lisina. Nota: le cellule transfettate può essere utilizzato fino a 24-72 ore dopo la trasfezione. Le cellule sono divise per fornire scivola copertura individuale per l'esperimento di patch clamp elettrofisiologia. 4. Elettrofisiologia 4,1 Soluzioni Preparazione Extracellulare (bagno) soluzione: 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0,5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2 e 10 HEPES mM (pH 7.4 insieme con NaOH). Aliquota 20K soluzione del bagno e aggiungere modulatori appropriato <ul><li> 20K + Ba 2 +: soluzione contenente 1 mM BaCl 2: uno specifico inibitore di rettificare le correnti verso l'interno </li><li> 20K + carbacolo: soluzione con mM carbacolo 5: un agonista M2R specifico; coppie M2R a G-proteine ​​che canali aperti GIRK </li><li> 20K + Etanolo: soluzione bagno contenente 100 mM EtOH per attivare canali GIRK direttamente </li></ul> Bagno di soluzioni luogo in siringhe (contenitori soluzione) del sistema rapido di perfusione a scambio. Nota: Usiamo un sistema pizzico Warner valvole per controllare le soluzioni bagno. Tubi in PE è raccomandato. Interno / soluzione elettrodo: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5.4 mM MgCl 2, 10 HEPES mM (pH 7,4) con 2,5 mM K 2 ATP e 0,3 mM GTP Li 2. Noi facciamo la soluzione elettrodo senza ATP e GTP. Noi a parte preparare aliquote di ATP e GTP, che sono conservati a -80 ° C, e aggiungere alla soluzione elettrodo, il giorno dell'esperimento. Manteniamo siringa con soluzione finale elettrodo sul ghiaccio per preservare la ATP / GTP. Noi filtro sterile (0,2 micron) le soluzioni interna / esterna per inibire la crescita microbica e ridurre la possibilità di intasamento dei tubi e l'elettrodo. 4,2 elettrodi Pulling Utilizziamo Narishige due fasi estrattore verticale e elettrodo di vetro borosilicato da Warner strumento (1,5 mm di diametro esterno, 0,86 mm di diametro interno e 7,5 cm di lunghezza) per ottenere elettrodi con 3-7 MΩ di resistenza quando è riempita di soluzione intracellulare. Nota: E 'necessario determinare sperimentalmente i parametri per l'estrattore elettrodo e il tipo di vetro dell'elettrodo nel vostro laboratorio. Per il nostro estrattore verticale, si usa una regolazione calore di 60,2 per il primo tiro e ~ 43 per la trazione secondo. 4,3 Whole-cell patch di bloccaggio <ol><li> Montare il coperchio scivolare in un piatto da 35 millimetri con piccola quantità di vaselina, coprire con soluzione esterna e piatto posto sul palco di un microscopio invertito a fluorescenza. Usa DIC di concentrarsi e trovare le celle, passare alla YFP fluorescenza per individuare YFP cellule positive. </li><li> Punta posizione di molteplici perfusione vicino a una cella verde (20-30 micron dalla cella di interesse = 2-3 lunghezza della cella a parte). </li><li> Riempire gli elettrodi con una soluzione, si attribuiscono alla headstage di amplificatore Axopatch 200B (Axon Instruments) con le seguenti impostazioni iniziali: Gain 1, Configurazione: intero a cellule β = 1, la modalità V-clamp. </li><li> Applicare una pressione positiva sul elettrodo per evitare l'intasamento della pipetta, e usare il manipolatore di inserire punta dell'elettrodo appena sopra la cella. </li><li> A zero il potenziale di pipetta, selezionare il pulsante di prova di tenuta per fornire un passo tensione di prova. I 5 step di tensione mV rettangolare appariranno nella finestra Sigillo Test di CLAMPEX. Regolare il potenziometro Pipettare Offset dell'amplificatore di portare la linea di base corrente a 0 nA. In alternativa, zero il potenziale di pipetta, disattivando la modalità amplificatore selettore V-track e la manopola metro per VTrack e utilizzare il potenziometro Pipettare Offset dell'amplificatore di portare la tensione sul display dello strumento amplificatore a "0,00". </li><li> Controllare la resistenza di elettrodo di comando utilizzando il test di tenuta del software 8,2 CLAMPEX (dovrebbe essere 3-7 MΩ). </li><li> Aprire un file di protocollo salvato o creare un nuovo protocollo. Per aprire file di protocollo selezionare dal menu principale Acquisire protocollo aperto e poi scegliere un file salvato protocollo di tensione. Per questo esperimento, il protocollo è stato creato per tenere potenziale di membrana a-40mV, fornire un unico punto di tensione 50 ms a -100 mV e rampa a +40 mV oltre 200 ms. Questo protocollo viene eseguito ogni 2 secondi. Il protocollo consente di rampa per l'osservazione della rettifica inversione di potenziale e verso l'interno dei canali GIRK. Per tensione canali ionici, un passo di tensione rettangolare può essere più appropriato. </li><li> Cellula approccio con la regolazione fine del manipolatore, il rilascio a pressione positiva, dopo aver toccato la superficie della cellula applicare la pressione negativa, e monitorare aumento della resistenza nella finestra dell'oscilloscopio Sigillo di prova. Una volta che la resistenza è nel range GΩ, l'elettrodo ha sigillato sul membrana (Gigaseal si è formata). </li><li> Applicare un impulso di pressione negativa per rompere la membrana cellulare e accedere all'interno della cellula. Una volta nella cellula intera configurazione, si registrerà un aumento correnti capacitive. </li><li> Passa alla prova membrana in CLAMPEX e scrivere l'accesso resistenza Ra, la resistenza Rm membrana, Cm capacità di membrana e verificare ad occhio la misura esponenziale della curva teorica alla corrente reale capacitivo. Capacità della membrana è proporzionale alla dimensione della cella e saranno utilizzati successivamente per calcolare la densità di corrente. </li><li> Tornare alla prova di tenuta, insieme V-Out (potenziale di membrana) a -40 mV e filtro a 10 kHz </li><li> Compensare la capacità della membrana e la resistenza serie l'amplificatore con le seguenti operazioni: <ol class="lalpha"><li> Accendere l'interruttore TUTTO PAC su CELL. Regolare PAC cellule intere, e compone RESISTENZA SERIE avanti e indietro, fino ad ottenere un impulso di piatto prova. Potrebbe anche essere necessario per regolare capacità VELOCE pipetta manopola PAC. </li><li> Accendere la manopola% PREVISIONE a circa il 60-80%, ancora una volta ri-regolazione della PAC a cellule intere, e il quadrante resistenza in serie (potrebbe essere necessario regolare la capacità pipetta compensazione manopola VELOCE PAC pure). </li><li> Accendere% COMP-al 100% senza oscillante della cella, cercando di mantenere le pulsazioni piatto di ri-regolazione della PAC cellula intera e resistenza in serie (potrebbe essere necessario regolare la capacità pipetta compensazione VELOCE manopola PAC pure). Regolare il ritardo riducendo il tempo costante. </li><li> Annotare i valori di Cm (capacità di membrana), R (resistenza serie), COMP%,% PRED e tempo ritardo impostato sull'amplificatore nel notebook. La Cm e Rs dovrebbe essere all'incirca la stessa Cm e Rm misurata nel test a membrana di cui sopra. </li></ol></li><li> Accendere valvola soluzione esterna per controllare la soluzione del bagno. Impostare l'amplificatore a 8 poli del filtro di Bessel per 2kHz, aprire un protocollo di tensione morsetto e iniziare la registrazione correnti. </li><li> Registriamo correnti GIRK utilizzando un protocollo rampa che passi a -100 mV per 50 ms poi rampe da 100 mV a +40 mV oltre 200 ms e viene consegnato ogni 2 secondi. Il protocollo consente di rampa per l'osservazione del potenziale inversione e per raddrizzante verso l'interno dei canali GIRK. A temperatura ambiente (22-25 ° C), il GIRK attuale dovrebbe invertire vicino a -50 mV (con 20 mM KCl nella vasca da bagno), che si trova vicino al potenziale di equilibrio calcolato per K (E K = -50 mV), quindi rimangono piuttosto piatto a potenziale positivo e K. </li><li> Protocollo sperimentale: Dopo la registrazione di una linea di base stabile, passare alla soluzione 20K + carbacolo e attendere picco di risposta, tornare a 20K soluzione del bagno, quindi applicare 20K Etanolo + e attendere risposta di picco, quindi passare alla 20K soluzione del bagno e, infine, 20K + Ba 2 + soluzione. Durante l'applicazione di questi farmaci si vedrà cambiamenti nella ampiezza di GIRK correnti (più pronunciata a -100 mV). Prendere nota del numero traccia corrispondente all'applicazione di diverse soluzioni extracellulari nel notebook. Un file Clampfit singolo conterrà tutti i spazza per l'intero esperimento. </li></ol> 5. Analisi dei dati Utilizziamo Clampfit 9,2 software per analizzare i dati correnti GIRK a -100 mV. <ol><li> Aprire il file con la registrazione, impostare il cursore a -100 mV. Per impostazione predefinita vedrete tutte le tracce sovrapposte sullo schermo. Premendo l'icona "Scrivi cursori" creerete Excel come foglio di calcolo con dati numerici. </li><li> Da X assegnando alla colonna numero di traccia e Y alla colonna di cursore e premendo l'icona "Create Graph" si può rapidamente disegnare una volta portate trama dell'esperimento. </li><li> Calcolare la corrente basale sottraendo corrente in presenza di Ba 2 + da correnti registrate in soluzione perfusione esterno da solo ("20K corrente" meno "20K + Ba 2 + corrente"). Calcolare le correnti indotte sottraendo corrente basale a 20K dalle correnti attivati ​​("20K + carbacolo corrente" meno "20K corrente", "20K + etanolo corrente" meno "20K corrente"). Calcolare la densità di corrente (pA / pF) dividendo l'attuale capacità di membrana (leggere direttamente dall'amplificatore). Calcolare l'attivazione per cento dividendo correnti indotte dalle correnti basale e moltiplicando per 100. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati Dovreste essere in grado di registrare corrente da cellule trasfettate con wild-type canali. Per la misura GIRK canalid nella soluzione extracellulare contenente 20 mM K + (e 145 mM K + intracellulare) che deve presentare una forte correzione verso l'interno e un potenziale inversione di circa -50 mV, che è una proprietà essenziale di canali del potassio. La wild-type corrente aumenterà fortemente su carbacolo applicazione (3-5 volte maggiore rispetto alle attuali basale) e di rispondere in modo simile al etanolo 100 mm. Nota: la convenzione di segno per elettrofisiologia è che la corrente interna è negativa e la corrente verso l'esterno è positivo. Per la mutazione L257W nella tasca di legame alcool GIRK2, vedrete le risposte attenuato sia per carbacolo ed etanolo. Questo suggerisce che L257 è coinvolto in alcool e l'attivazione delle proteine ​​G di GIRK2 canali. Per ulteriori esempi dei risultati di GIRK2 mutagenesi, vedi recente pubblicazione da parte Aryal et al. 1. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Finestra di Clampfit 8,0 mostra i dati per il file di wild-type di registrazione GIRK2. Pannello in alto a sinistra mostra sovrapposte spazza registrato in risposta ad un protocollo di rampa di tensione in presenza di differenti soluzioni esterne bah. Cursore 1 è posizionato a -100 mV. I valori del cursore vengono scritti nel foglio di calcolo (pannello destro). Inferiore del pannello a sinistra mostra la trama del numero spazzare contro, la corrente. Si noti l'aumento di corrente (deflessione verso il basso) con etanolo (EtOH) e carbacolo (CARB) e inibizione della corrente con Ba 2 +. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Descrizioni finestra di Clampfit 8,0 file mostra dati per un mutante GIRK2-L257W registrazione. Sono come nella figura 1. Rilevare la perdita di carbacolo (CARB) l'attivazione e la riduzione delle EtOH-correnti indotte nei canali mutanti.

<ol><li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li>
<li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K%2B+channels+examined+by+scanning+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Phys%22%5BJournal%5D)">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li>
<li>Doyle, D. A., Cabral, M. orais, Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+potassium+channel%3A+molecular+basis+of+K%2B+conduction+and+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li>
<li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li>
<li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K%2B+channel+Kir2.2+at+3.1+%26Aring%3B+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Mutagenesi sito-diretta è un classico approccio per lo studio relazioni struttura-funzione dei canali ionici. Si basa sul presupposto che modificando un residuo critico del canale ionico si dovrebbe essere in grado di osservare i cambiamenti pronunciato nella funzione del canale. Al contrario, le mutazioni in molti non critici posizione può essere introdotta senza perturbazioni importanti per la funzione di canale. Tipicamente, il residuo in questione è prima mutato in alanina, un piccolo non polare aminoacido, seguita dalla mutazione di triptofano, il più grande di aminoacidi 2. Se il residuo è importante per la funzione di canale, sia le mutazioni cambierà l&#39;attività del canale. Se un residuo meno essenziale è mutato, gli effetti della mutazione, in particolare ad alanina sono spesso irrilevanti. Mutazioni triptofano hanno maggiori probabilità di causare cambiamenti a causa di impedimenti sterici legata alle dimensioni triptofano. Spesso, quando l&#39;informazione strutturale è carente, mutazione sistematico alanina o triptofano all&#39;interno di un frammento di canale (chiamato alanina o triptofano scansione) possono essere utilizzati per individuare residui di critica. E &#39;importante notare che i cloni multipli con mutazioni puntiformi diverse possono essere preparati in parallelo permettendo di analisi dei residui multipli all&#39;interno di tempo relativamente breve. Di recente, strutture cristalline più dei canali si sono resi disponibili 3,4,5. Essi possono essere utilizzati per proporre eventuale presenza di residui chiave per essere testati utilizzando l&#39;approccio descritto in questo protocollo. Misure su wild-type canale dovrebbe sempre accompagnare la misura di un canale mutante per servire come controllo positivo per garantire che gli esperimenti di trasfezione ed elettrofisiologiche sono state fatte correttamente. Mutazioni puntiformi può portare alla mancanza di una corrente funzionale, una simile corrente al regolamento wild-type o alterata dell&#39;attività canale. La mancanza di corrente misurabile può essere dovuto al traffico improprio pieghevoli o alterato. In tal caso può essere utile per scoprire se il canale traffici correttamente alla superficie usando un test biotinilazione o immunofluorescenza contro tag extracellulare (senza permeabilizzazione cellulare) per distinguere tra non funzionali dei canali sulla membrana plasmatica e canali trattenuto all&#39;interno della cellula . Infine, è consigliabile indagare non solo l&#39;attività basale del canale, ma anche le conseguenze della mutazione sulla regolazione del canale. Diversi meccanismi di modulazione della funzione di canale potrebbe essere studiata in funzione del canale ionico di interesse, tra cui la regolamentazione da parte delle proteine ​​G, PIP2, ioni, concentrazione di ATP, fosforilazione (con tirosina, serina o treonina mutazione), ubiquitinazione o sumoilazione (utilizzando mutazione lisina) e apri canale diretto o bloccanti.

<table><tbody><tr><td>Prodotti chimici</td><td>Sigma</td><td>Varia</td><td></td></tr><tr><td>Kit Mini Prep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Radiacwash</td><td>Biodex</td><td>005-100</td><td></td></tr><tr><td>Idrobromuro di poli-D-lisina</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40210</td><td>Si può utilizzare anche poli-L-lisina</td></tr><tr><td>Kit Maxi Prep</td><td>Qiagen</td><td>12263</td><td></td></tr><tr><td>Kit QuickChange XL II per mutagenesi sito-diretta</td><td>Stratagene</td><td>200512-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Coprioggetti &amp;#710;&amp;#8230; 12 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>CS-12R</td><td></td></tr><tr><td>Tubulatura capillare in vetro borosilicato – parete standard</td><td>Warner Instruments</td><td>G150-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="blank"&gt;Microscopio a fluorescenza invertito&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Leica</a></td><td>DMI3000 B</td><td></td></tr><tr><td>Elettrofisiologia</td><td>Nikon/&lt;br/&gt;Leica/&lt;br/&gt;Zeiss</td><td>Qualsiasi microscopio invertito DIC&lt;br/&gt;(Hoffmann)&lt;br/&gt;con fluorescenza</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Axopatch 200B amplificatore</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di perfusione</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6 Perfusion MM-6</td><td></td></tr><tr><td>Convertitore analogico-digitale</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1320 convertitore digitale</td><td></td></tr><tr><td>Manipolatori</td><td>Sutter Instruments</td><td>Manipolatore: MP-85</td><td></td></tr><tr><td>Tiratore di elettrodi</td><td>Narishige</td><td>PC10 tiratore verticale di elettrodi</td><td></td></tr><tr><td>Tavolo antivibrazioni</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>Tavolo pneumatico</td><td></td></tr></tbody></table>

mutagenesi e analisi funzionale dei canali ionici heterologously espresso in cellule di mammifero

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Dimostreremo come studiare gli effetti funzionali di introdurre una mutazione puntiforme in un canale ionico. Studiamo proteina G-dipendenti di potassio dentro rettificazione (denominato GIRK) canali, che sono importanti per la regolazione della eccitabilità dei neuroni. Ci sono quattro diversi mammiferi subunità del canale GIRK (GIRK1-GIRK4) - ci concentriamo sulla GIRK2 perché forma un homotetramer. La stimolazione di diversi tipi di proteine ​​G recettori accoppiati (GPCR), come il recettore muscarinico (M2R), porta all&#39;attivazione di canali GIRK. L&#39;alcool inoltre attiva direttamente canali GIRK. Mostreremo come mutare uno specifico amminoacido da cambiare una o più nucleotidi nel cDNA per il canale GIRK. Questa sequenza mutata cDNA sarà amplificato nei batteri, purificata, e la presenza della mutazione puntiforme sarà confermata dal sequenziamento del DNA. Il cDNA per i canali mutato e wild-type GIRK saranno trasfettate in cellule renali embrionali umane HEK293T coltivati ​​in vitro. Infine, whole-cell patch-clamp elettrofisiologia saranno utilizzati per studiare le correnti macroscopiche di potassio attraverso i canali ectopica espresso GIRK wild-type o mutato. In questo esperimento, esamineremo l&#39;effetto di una mutazione L257W in GIRK2 canali di attivazione M2R-dipendente e l&#39;alcol-dipendente.

Dimostreremo come studiare l&#39;effetto di una singola mutazione puntiforme sulla funzione di un canale ionico.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

Dimostreremo come studiare gli effetti funzionali dell'introduzione di una mutazione puntiforme in un canale ionico. Studiamo i canali rettificatori entranti regolati dalle proteine G...

I canali del potassio rettificanti inwardmente attivati dalle proteine G o grk sono importanti per regolare l'eccitabilità dei neuroni. I gks possono essere attivati sia da recettori accoppiati a proteine G (GPCR), come il recettore muscarinico M2R, sia dall'alcol, al fine di studiare gli effetti di mutazioni nel sito di legame dell'alcol sul gerk. Alla loro attivazione, una mutazione puntiforme viene introdotta nel cDNA del grk mediante mutagenesi diretta al sito; costrutti purificati di gerk sono trasfettati, insieme a costrutti YFP, in cellule mammifere, e l'efficienza di trasfezione viene valutata mediante imaging a fluorescenza.L'analisi con tecnica patch clamp su cellula intera viene quindi eseguita per confrontare l'attivazione dipendente dall'alcol e dalle proteine G. Questa dimostrazione sperimentale visiva fornirà informazioni essenziali su come studiare la funzione dei canali LY. Oggi esamineremo una domanda relativa al modo in cui l'alcol attiva i canali di gruppo.La tecnica di neoformazione mirata qui mostrata può fornire informazioni sul funzionamento dei canali ionici. Questa tecnica può essere applicata anche ad altri sistemi in cui è noto che una mutazione in un gene provochi una malattia umana. Queste sono dimostrazioni della tecnica di patch-clamp su cellule calde, la cui padronanza è fondamentale poiché comprende numerosi passaggi che richiedono precisione, un'adeguata compensazione elettronica e pratica per generare dati utilizzabili.Il DNA utilizzato per la trasfezione in questo protocollo viene preparato come segue. In primo luogo, il subunità GRK, il DNA ottenuto dalla PCR viene clonato direttamente nel plasmide di espressione mammifera. Nel plasmide PC DNA 3.1 vengono introdotte mutazioni puntuali mediante primer opportunamente progettati insieme al kit di mutagenesi direzionata Quick Change XL a due siti.Utilizzando questo sistema, viene eseguita una PCR in cui l'intero plasmide viene replicato e vengono introdotte mutazioni puntiformi codificate dai primer. Dopo la PCR, i plasmidi replicati vengono digeriti con l'enzima di restrizione DPN uno e quindi trasformati mediante shock termico in e coli XL 10 gold ultra competent. I batteri trasformati vengono coltivati su piastre di agar LB contenenti ampicillina; i batteri che ospitano il plasmide sono resistenti all'ampicillina e formeranno colonie.Le colonie isolate vengono prelevate e coltivate in colture minimes. Vengono eseguiti mini-prep per isolare il DNA plasmidico. Il DNA viene quindi sequenziato per identificare i mutanti correttamente trasformati.I batteri E. coli vengono coltivati in un lotto più grande e vengono effettuate preparazioni in scala maggiore per ottenere quantità elevate di DNA plasmidico; piastrare circa 1 × 10⁵ cellule HEC 293 T in ciascuna di due pozzette di una piastra a 12 pozzette, una per il mutante e una per il controllo. Incubare il canale di tipo selvaggio a 37 °C.Dopo otto-24 ore, le cellule aderiranno al loro substrato e saranno pronte per la trasfezione. Trasfettare le cellule con lipo 2000 seguendo le istruzioni del produttore, utilizzando 0,2 microgrammi di canale CDNA, 0,4 microgrammi di recettore M due R CDNA e 0,04 microgrammi di Y-F-P-C-D-N-A. Per identificare le cellule trasfettate con successo, incubare le cellule per 24 ore.Trascorso il tempo desiderato di incubazione, posizionare le cellule sul piano di un microscopio a fluorescenza invertito per determinare l'efficienza di trasfezione. Confrontare le immagini fluorescenti con quelle DIC per stabilire la percentuale di cellule trasfettate. Riportare la piastra di coltura nell'incubatrice.Pulire le coprioggetti di vetro da 12 millimetri e conservarle in etanolo fino all'uso. Rimuovere l'etanolo residuo flambéndole nell'armadio sterile. Posizionare le coprioggetti in una piastra a 24 pozzetti e ricoprirle con 0,2 milligrammi per millilitro.Poli-lisina 24 ore dopo la trasfezione, si trattano le cellule con tripsina e si seminano quattro volte 10 alla tre cellule per pozzetto in quattro-otto pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente coprioggetti di vetro rivestiti con poli-lisina. Incubare per ulteriori 24-48 ore prima di eseguire la tecnica del patch clamping su cellule intere. Preparare gli elettrodi per il patch utilizzando un estrattore verticale a due passaggi e vetro elettrodico di borosilicato.Il microelettrodo finito dovrebbe idealmente presentare una resistenza compresa tra tre e sette megaohm e non richiedere ulteriori manipolazioni, come la lucidatura termica. Per la tecnica del patch clamping, posizionare un'ogiva con cellule transfezionate in una piastra da 35 millimetri contenente una soluzione esterna con 20 millimolari di potassio o 20 K. Posizionare la piastra sul portacampioni di un microscopio a fluorescenza invertito.La configurazione di patch clamping utilizzata in questo caso impiega un sistema di perfusione. Questo sistema contiene le soluzioni extracellulari che verranno applicate alle cellule, alimentate per gravità attraverso tubi collegati a un collettore. Ogni soluzione è controllata a distanza mediante una valvola a spillo comandata da un solenoide.Utilizzare la DIC per mettere a fuoco e individuare le cellule. Passare al filtro YFP per localizzare le cellule positive per YFP. Una volta identificate le cellule positive per YFP, posizionare la punta del sistema di perfusione, cellula neurofluorescente, a 20-30 micron o a due-tre lunghezze cellulari di distanza.Riempire un elettrodo con soluzione elettrodica interna. Utilizzando una siringa e un ago flessibile, battere delicatamente sull'elettrodo riempito per rimuovere le bolle d'aria dalla punta. Collegare gli elettrodi allo stadio di testa di un amplificatore AXO patch 200 B.Verificare nuovamente che le impostazioni sull'amplificatore corrispondano a una configurazione. L'interruttore per la cellula intera è impostato su beta uguale a uno, e il filtro passa-basso è regolato a 10 chilohertz. Applicare una pressione positiva con la siringa e la pinza per mantenere pulita la punta dell'elettrodo.Quindi utilizzare un micromanipolatore per posizionare la punta dell'elettrodo nel bagno e spostarsi al di sopra della cellula. Passare l'amplificatore in modalità V track e la manopola del misuratore in V track. Quindi utilizzare il misuratore del potenziale di offset della pipetta sull'amplificatore per azzerare il potenziale della pipetta, portando il voltaggio visualizzato sul misuratore dell'amplificatore a 0,00.In alternativa, passare alla modalità clamp di tensione sull'amplificatore e selezionare il pulsante del test per applicare un impulso di tensione di prova. L'impulso di tensione rettangolare apparirà nella finestra di test del sigillo del clamp. Regolare l'offset della pipetta sull'amplificatore per portare la corrente di base a zero nanoampere.Il test di sigillatura mostrerà la resistenza dell'elettrodo, che dovrebbe essere compresa tra tre e sette megaohm. Chiudere quindi la finestra del test di sigillatura. Selezionare acquisisci protocollo aperto nel menu a discesa.Quindi selezionare un protocollo di tensione salvato. In questo caso, il protocollo selezionato è stato preprogrammato per applicare un singolo passo di tensione da meno 100 millivolt a più 40 millivolt ogni due secondi. Questo protocollo a rampa consente l'osservazione del potenziale di inversione e della proprietà di rettificazione entrante dei canali GK.Per i canali ionici attivati dal voltaggio, un gradino rettangolare di voltaggio potrebbe essere più appropriato; utilizzando la regolazione fine del micromanipolatore, avvicinarsi alla cellula, rilasciare la pressione positiva e, dopo aver toccato la superficie cellulare, applicare una leggera pressione negativa. Monitorare l'aumento risultante della resistenza nel test di sigillo. Una volta che la resistenza raggiunge il valore nell'ordine dei gigaohm, l'elettrodo si è sigillato sulla membrana.Questo è definito sigillo giga. Utilizzando una siringa, applicare un impulso di pressione negativa per rompere la membrana e ottenere l'accesso alla cellula. Una volta raggiunta la configurazione a intera cellula, il test del sigillo registrerà ampie correnti capacitive visibili come picchi o transitori all'inizio e alla fine del test.Test del polso nel controllo di tenuta. Successivamente, fare clic sul pulsante del test della membrana. Nel clamp X, registrare la resistenza di accesso e la resistenza della membrana.Una capacità della membrana in un notebook verifica visivamente l'adattamento esponenziale. La capacità della membrana è proporzionale alle dimensioni della cellula e verrà utilizzata per calcolare la densità di corrente accessibile. La resistenza e la resistenza della membrana vengono utilizzate per valutare se la registrazione sarà soddisfacente per proseguire.Una buona registrazione avrà una bassa resistenza di accesso. Chiudere ora la finestra del test sulla membrana e fare nuovamente clic sul pulsante del test di sigillo nella finestra del test di sigillo; impostare V out a meno 40 millivolt per compensare la capacità della membrana e la resistenza in serie sull'amplificatore, attivare la modalità whole cell, regolare avanti e indietro il condensatore della cellula intera e la resistenza in serie finché il transitorio non viene minimizzato e la corrente diventa una linea piatta. Se necessario, regolare la capacità della pipetta con la manopola del condensatore rapido sull'amplificatore.Una compensazione eccessiva o insufficiente lascerà un transitorio di capacità residua. Successivamente, ruotare la manopola della percentuale di predizione al 60-80% e riaggiustare la resistenza di serie della capacità in modalità whole cell e la capacità rapida secondo necessità, al fine di ottenere una linea piatta nel test di sigillo. Infine, ruotare la compensazione percentuale a circa il 100% senza far oscillare la cellula, cercando nel contempo di mantenere l'impulso il più lineare possibile mediante ulteriore regolazione dei potenziometri della resistenza di serie della capacità in modalità whole cell e della capacità rapida.Dopo aver raggiunto la compensazione della resistenza e della capacità, annotare su un taccuino il valore impostato per la percentuale di resistenza di serie del condensatore dell'amplificatore, la percentuale di compensazione, la previsione e il tempo di ritardo, quindi aprire la valvola della soluzione esterna per la soluzione da bagno di controllo 20 K. Impostare il filtro del vaso passa-basso sull'amplificatore a due kilohertz. Quindi iniziare la registrazione delle correnti cliccando sul pulsante di registrazione nel software.Cercare la proprietà di rettificazione interna della corrente ger. Questa si manifesta come una corrente interna ampia negativa rispetto al potenziale di inversione del potassio, determinato dall'equazione di Nernst EK, e come una corrente esterna ridotta positiva rispetto a ek. Dopo aver registrato una baseline stabile, determinare l'attivazione mediata dai recettori delle correnti applicando la soluzione extracellulare 20 k più carbacolo.Una volta osservata l'attivazione massima e raggiunto lo stato stazionario della corrente, tornare alla soluzione con K e attendere finché non si raggiunge il livello di corrente di base. Successivamente, per studiare l'attivazione da alcol delle correnti gert, passare alla soluzione esterna con 20 k più 100 millimolare di etanolo e attendere la risposta massima.Quindi tornare alla soluzione di raffreddamento a 20 K e attendere finché non si raggiunge il livello di corrente di base. Infine, per determinare le correnti basali di gert, passare alla soluzione di 20 K più 20 K di bario e attendere la risposta in questa condizione. L'inibizione della corrente gerk dovrebbe essere evidente, risultando più pronunciata a meno 100 millivolt durante tutta la procedura.Si noti il numero della traccia corrispondente all'applicazione di diverse soluzioni extracellulari. Un singolo file di acquisizione in regime di clamp conterrà tutte le tracce per l'intero esperimento. Per analizzare i dati di GK, utilizzare il software Clamp FIT 8.2.Secondo le istruzioni riportate nel protocollo scritto allegato, sono state ottenute due diverse registrazioni in blocco da cellule HEC 2 9 3 T che esprimono canali GK di tipo selvaggio o mutanti, e analizzate seguendo le indicazioni di questo video, come mostrato qui per il tipo selvaggio GK due. Il pannello a sinistra contiene una finestra con diverse correnti sovrapposte generate dal protocollo di rampa di tensione in presenza di diverse soluzioni. Si noti la rettificazione in ingresso.Questa è la corrente entrante più grande a -100 millivolt intorno ai 50 millisecondi sul tracciato della corrente. La piccola corrente uscente tra 0 e +40 millivolt intorno ai 200-260 millisecondi sul tracciato della corrente origina da un canale del potassio endogeno con gate voltaggio-dipendente. Non è la corrente Gert.Uno viene posizionato sul valore massimo della corrente entrante, e i valori del cursore vengono riportati nel foglio di calcolo. Nel foglio di calcolo si vedono il numero della traccia e la corrente a meno 100 millivolt.I dati includono la corrente basale, le correnti indotte da carbacol e quelle evocate dall'alcol, oltre a una corrente inibita dal bario. Allo stesso modo, le correnti durante una rampa di tensione in presenza di diverse soluzioni. Sono mostrate le correnti per il canale mutante L 2 57 w in presenza di 20 k più 100 millimolar etanolo o 20 k più cinque millimolar carbacol o 20 k più bario.Si noti la notevole riduzione delle correnti indotte da alcol e carbo-alcol. Questi risultati suggeriscono che questo residuo svolge un ruolo importante nella modulazione dei canali GK da parte dell'alcol e delle subunità g beta gamma. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come costruire una mutazione in un gene e iniziare a studiarne l'effetto sulla funzione del canale utilizzando tecniche elettrofisiologiche avanzate.Una volta padroneggiata, questa tecnica di neogenesi guidata può essere eseguita in due o tre giorni e ampliata fino a comprendere cinque o più mutazioni. Lo sviluppo di queste tecniche ha aperto la strada ai biofisici dei canali ionici per esplorare le proprietà fondamentali della funzione e della gating dei canali ionici. Inoltre, consentono ai ricercatori di studiare le malattie umane causate da una singola mutazione in un gene di canale ionico.

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