Name: Crescita e la differenziazione degli adulti ippocampale suolo artico Cellule Staminali neurali Squirrel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Impara a coltivare e differenziare cellule staminali neurali adulte dell'ippocampo di scoiattolo artico per studiare neurogenesi e tolleranza ischemica. Questo metodo permette di ottenere neuroni e glia in proporzioni bilanciate.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla US Army Medical Research e Materiel Command concedere # 05178001 e NS041069-06 presso l&#39;Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo. Ringraziamo Joel Vonnahme per gli utili commenti sul protocollo.

1. AGS Neural Stem Cell e Media Preparazione <ol><li> Adulti dell'ippocampo scoiattolo di terra Artico (AGS), le cellule staminali neurali isolate in un modo descritto in precedenza 9 possono ora essere ottenuti commercialmente come fiale crioconservati. Le cellule sono pillole in confezioni isolati contenenti ghiaccio secco per assicurare che le cellule rimangono in uno stato crioconservati. Per mantenere l'integrità, decomprimere le cellule immediatamente dopo la ricezione e conservare a inferiore a -150 ° C, o in fase vapore di un Dewar di azoto liquido. </li><li> Preparare agsNSC medio basale + 5% FBS FBS aggiungendo 5 ml (LS-1012) a 95 ml di mezzo agsNSC basale </li><li> Preparare Media agsNSC di espansione con l'aggiunta di 500 microlitri B-27 Supplemento (Invitrogen) a 50 ml di mezzo agsNSC basale. Dividere il resto della B27 in 1 ml di aliquote e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso. </li><li> Caldo 25 mL di agsNSC medio basale + 5% FBS e 20 ml di terreno di espansione agsNSC in un bagno d'acqua a 37 ° C. </li><li> Fiaschi cappotto usato per l'espansione con poli-L-ornitina <ol><li> Scongelare il poli-L-ornitina (10 mg / ml) soluzione di lavoro. Conservare la soluzione tra 2-8 ° C fino a un mese, una volta scongelati. </li><li> Aggiungere 8 ml di soluzione di poli-L-Ornitina lavorando ad uno sfogo T-75 pallone e distribuire uniformemente la soluzione su tutta la superficie intera cultura del pallone. (Definire la quantità di soluzione di lavoro per i pescherecci altra cultura che può essere utilizzato Usa 0.5 -.. 1,0 mL Poli-L-ornitina soluzione di lavoro per 10 cm 2 di superficie cultura) </li><li> Incubare fiaschi a 37 ° C per un minimo di 24 ore. (L'uso di un incubatore senza aggiunta di CO 2 è preferibile per l'incubazione di Poly-L-ornitina recipienti di coltura rivestito.) Fiaschi rivestiti possono essere conservati per un massimo di due settimane in incubatrice. </li><li> Prima dell'uso, aspirare Poli-L-ornitina soluzione di lavoro dal pallone e lavare due volte con acqua sterile colture di tessuti di qualità. Aspirare il liquido fino a quando il pallone è quasi asciutto prima dell'uso. </li></ol></li><li> Rimuovere una fiala dal Dewar e controllare che il tappo del flaconcino sia ben sigillato. Tenere la parte superiore del flaconcino lasciando la metà inferiore del flacone in un bagno d'acqua a 37 ° C per circa 60-90 secondi o fino a fiala è quasi completamente scongelati; una piccola quantità di ghiaccio dovrebbe essere ancora visibile. Per evitare potenziali contaminazioni, conservare il tappo del flacone fuori dall'acqua. Non più di disgelo, in quanto ciò potrebbe danneggiare le cellule. </li><li> Spruzzare l'esterno del flaconcino con 70% di etanolo o isopropanolo, poi posto la fiala in un armadio di sicurezza biologica. Togliere il tappo con attenzione per evitare la contaminazione o splatter. </li><li> Risospendere delicatamente le cellule nel flaconcino con l'aggiunta di 1 ml di agsNSC mezzi basale + 5% FBS usando una pipetta sterile. Trasferire la risospensione delle cellule a 25 mL di caldo Media agsNSC basale + 5% FBS in un tubo da 50 ml per centrifuga. </li><li> Sciacquare la crio-fiala una volta con sospensione cellulare diluito. Centrifugare le cellule a 150 xg per 6 minuti. Per ottenere risultati ottimali, calcolare la velocità per ogni tipo di centrifuga individuo. </li><li> Mentre le cellule girano verso il basso, aggiungere 10 ml di terreno di espansione agsNSC al secco poli-L-ornitina rivestito T-75 beuta e aggiungere 40 ml di rh FGF-base (40ng/mL). Dopo la centrifugazione, aspirare il liquido surnatante avendo cura di non aspirare il pellet. Risospendere le cellule in 10 ml di terreno di espansione agsNSC. Trasferire la ri-sospensione cellule in terreno di espansione agsNSC nei media nel T-75 pallone. </li><li> Agitare delicatamente il recipiente di coltura da lato a lato per distribuire uniformemente le cellule all'interno del vaso. </li><li> Cultura nave posto seminato a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Le cellule devono allegare al pallone e cominciano a formarsi i processi entro due ore dalla semina. Se le cellule rimangono galleggianti e appallottolato all'interno del mezzo, quindi centrifugare cellule in FBS 5% ed eseguire passi 1,8-1,10 con terreno fresco e pallone. </li></ol> 2. Ampliamento della AgsNSC <ol><li> Due giorni (~ 48 ore) dopo lo scongelamento e la semina delle cellule, una sostituzione medio completo dovrebbe essere eseguito utilizzando 20 ml di terreno di espansione agsNSC più un picco di 40 ml di rh FGF-base. </li><li> Fiaschi Spike con 40 ml di rh FGF-base sul inoculazione giorno successivo. Le celle saranno pronti per trypsinize quando hanno raggiunto il 75-80% confluenza con il terzo o quarto giorno dopo l'inoculazione. Coltura le cellule staminali indifferenziate per più di 4 giorni dopo l'inoculazione non è raccomandato perché più incubazione consentono alle cellule di cominciare a differenziare di neuroni e neuroni possono essere ferito da tripsinizzazione durante la fase 3. Il rh FGF-base può essere conservato a 4 ° C per un massimo di una settimana e ancora mantenere l'attività. Il rh FGF-base può anche passare attraverso uno congelamento aggiuntivo / disgelo a -20 ° C se occorre più tempo. </li></ol> 3. Tripsinizzazione delle cellule <ol><li> agsNSC dovrebbero essere diversi passaggi 3 a 4 giorni dopo l'inoculazione. Preparare una poli-L-ornitina fiasco rivestito tra 24 ore e una settimana prima passaging se il agsNSC sarà ampliato di nuovo. </li><li> Aspirare ilmedio dalla nave cultura. Aggiungere 2,5 ml di 0,05% Trypsin/0.02% EDTA (CM-0017) per la nave per ogni cm 75 2 di superficie. Agitare delicatamente per garantire tutte le cellule sono rivestite con la tripsina / EDTA. Normalmente le cellule cominciano a staccarsi dalla superficie entro 60 secondi, a seconda della confluenza delle cellule. Non più di trypsinize, in quanto questo potrebbe danneggiare le cellule. Picchiettando delicatamente il recipiente di coltura da più lati incoraggerà distacco. </li><li> Una volta che le cellule si staccano, aggiungere 10 ml di agsNSC medio basale + 5% FBS al pallone. Agitare delicatamente per assicurare tutta la soluzione tripsina viene neutralizzata. Utilizzando tecniche di laboratorio asettico, pipettare le cellule in una provetta sterile contenente 10 ml di agsNSC basale media +5% FBS. Ripetere lavando il pallone di nuovo con un ulteriore 10 ml di agsNSC medio basale + 5% FBS e si combinano con il primo lavaggio. </li><li> Cellule Centrifugare a 150 xg per 6 minuti come descritto sopra. Dopo la centrifugazione, le cellule dovrebbero formare un ambiente pulito pellet sciolto. Aspirare tripsina e medie neutralizzato dalla provetta e risospendere il pellet cellulare in 10 ml (per T-75 fiasco) di pre-riscaldato a medio basale agsNSC + 5% FBS pipettando gentilmente su e giù 2X con una pipetta 10 ml. Eseguire un numero di celle come descritto di seguito. </li></ol> 4. Di calcolo standard per la placcatura di celle <ol><li> Utilizzando una tecnica asettica, agitare la sospensione cellulare e trasferire 15 microlitri della sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere 15 ml di 0,4% Tricloroetano. Mescolare delicatamente e carico 10 ml di sospensione cellulare a ciascuna delle camere di un emocitometro pulito come una linea di colore conteggio Camera (catalogo # 1490: Hausser scientifico, <a href="http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm</a> ). </li><li> Contare un minimo di 4 quadranti sul emocitometro. Le cellule blu che sono positivi per Tricloroetano sono morti e non devono essere conteggiati. Per la conta delle cellule preciso, il numero ottimale di cellule per quadrante dovrebbe essere 25-75 cellule. </li><li> Dopo il conteggio delle cellule, calcolare la media dei 4 quadranti. Moltiplicare la media conta delle cellule da 10.000 e per il fattore di diluizione (2 se si utilizza il volume consigliato) per determinare il numero di cellule per ml. Si noti che se la vitalità percentuale totale è inferiore al 92% ci può essere un certo numero di cause. Una delle ragioni di vitalità basso può essere più tripsinizzazione, prima di tripsina neutralizzazione con FBS. Un altro motivo potrebbe essere che la concentrazione di siero (FBS) per tripsina è troppo bassa e le cellule continuano a essere trypsinized. In terzo luogo, le cellule potrebbero essere stati troppo confluenti, provocando le cellule staminali a differenziarsi a causa di contatto cellula-cellula, portando a lesioni durante tripsinizzazione. Se questo metodo viene seguito da vicino un rendimento di 3 o più raddoppi ci si può aspettare, dando una popolazione di&gt; 4.000.000 cellule da un numero iniziale di circa 500.000. </li></ol> 5. Inoculazione di un altro pallone di espansione <ol><li> Per determinare il numero totale di cellule necessario per inoculare una nave, moltiplicare la densità di semina desiderata (6.600 cellule per cm 2 o 500.000 cellule per T-75 fiasco) per la superficie (in cm 2) della nave per essere inoculati. Se inoculando più di una nave moltiplicare il numero di cellule per nave per il numero totale di navi. Per determinare il volume (ml) di sospensione cellulare necessario per inoculare ciascuna nave, dividere il numero di cellule necessario per inoculare una nave per il numero di cellule vitali / mL nella sospensione cellulare. Se inoculando più di una nave calcolare il volume totale di sospensione cellulare necessari moltiplicando il volume necessario per una nave per il numero totale di navi da inoculare. </li><li> Centrifugare il volume desiderato di cellule in agsNSC medio basale + 5% FBS, lasciando perdere pellet. Normalmente 500.000 cellule sono portati ad un volume totale di 25 mL in agsNSC medio basale +5% FBS come descritto in precedenza. Aspirare il liquido e risospendere il pellet sciolto in 10 ml di terreno di espansione agsNSC è richiesto Questo ulteriore fase di centrifugazione per rimuovere FBS prima dell'inoculazione. Aggiungere 10 ml di pre-riscaldato Media Expansion agsNSC al T-75 pallone. Aggiungere i 10 ml di sospensione cellulare risospeso per il T-75 Pallone poi aggiungere 40 ml di rh FGF-base al pallone. Si consideri che il tripsinizzazione e inoculazione non dovrebbe richiedere più di 1,5 ore per decidere il numero massimo di flaconi di lavorare con in qualsiasi momento. Si dovrebbe anche avere mezzi sufficienti per completare le modifiche dei media se si utilizza numerosi palloni. </li><li> Scuotere delicatamente il pallone da un lato all'altro per distribuire uniformemente le cellule e il luogo in recipienti di coltura a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore, come descritto in precedenza. </li></ol> 6. Diluizione delle cellule per l'inoculazione dei pozzetti per la differenziazione <ol><li> Qualsiasi multi-ben formato può essere utilizzato, ma inoculazione in BD Biocoat Poli-L-lisina rivestito Piastre a 96 pozzetti è described qui. Determinare il volume di sospensione cellulare necessari per l'esperimento moltiplicando il numero di pozzi di essere inoculato con 0,2 ml per bene per un multi-ben 96 piastra e aggiungere circa il 10% per coprire eventuali perdite di volume durante l'inoculazione. Calcolare la diluizione di una densità cellulare di 75.000 cellule / ml. Determinare la quantità di FBS da aggiungere alla media differenziazione per ottenere una concentrazione finale del 2% FBS (Tabella 1). Mescolare la FBS e medie differenziazione. Mescolare accuratamente le celle con il volume calcolato di media Differenziazione con FBS. (Nota: Durante la centrifugazione le cellule sono in agsNSC medio basale + 5% FBS FBS Mentre protegge le cellule durante la centrifugazione e facilita l'adesione delle cellule FBS inibisce differention Diluizione FBS al 2% consente l'adesione delle cellule alla superficie multi-bene... Il FBS 2% è poi ulteriormente diluita per promuovere la differenziazione. Insulin-transferrina-selenio (ITS-e) è incluso anche nel medio differenziazione di promuovere la differenziazione. </li><li> In un armadio biosicurezza, dispensare 200 uL di sospensione cellulare diluito in un serbatoio Combitip sterile a ciascun pozzetto di una poli-L-lisina placca rivestita da 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale e suggerimenti orifizio di grandi dimensioni. Incubare le piastre per 1,5-2 ore a 37 ° C, 5% di CO 2. Dopo che le cellule hanno attaccato, dopo circa 90 a 120 minuti, rimuovere con attenzione il 50% (100 microlitri per 96 pozzetti) del mezzo da ogni orifizio suggerimenti e di grandi dimensioni utilizzando pipetta. Ricollocare accuratamente il volume rimosso con acqua calda Media Differenziazione agsNSC, sempre con grande puntali orifizio. (L'uso di punte orifizio standard possono ferire le cellule). </li><li> Due giorni dopo l'inoculazione (~ 48 ore), effettuare un cambio medio del 50% con medie agsNSC Differenziazione e grandi puntali orifizio. </li></ol> 7. Manutenzione di neuroni <ol><li> Preparare media neuronale manutenzione utilizzando NeuraLife, glutammina e B27 per le istruzioni. Media manutenzione neuronale deve essere preparata ogni settimana. </li><li> Due giorni dopo l'ultima modifica agsNSC Media differenziazione, di solito 4 ° giorno dopo l'inoculazione, effettuare una sostituzione medio del 50% con medie di manutenzione neuronale. </li><li> Continuare a svolgere sostituzioni medio del 50% con medie neuronale di manutenzione ogni 2 o 3 giorni. Processi neuronali dovrebbe apparire entro un paio di giorni di cambiare a medio manutenzione neuronale. Le cellule devono essere utilizzati entro 3 settimane di essere trasferito al terreno di mantenimento neuronale. I neuroni possono essere identificati con un numero di marcatori neuronali disponibili in commercio. Astrociti anche sempre essere osservate. </li><li> Popolazioni di cultura tipicamente esprimono un rapporto superiore al 40% dei neuroni al numero totale delle cellule. L'uso di mezzi di manutenzione dei neuroni diversi NeuraLife possa fornire cellule inferiori che non guardano morfologicamente mature e non possono sopravvivere a lungo in coltura. </li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: Il suolo artico scoiattolo cellule staminali adulte neurali continueranno a raddoppiare ogni 24 ore per 3 a 5 giorni per almeno due passaggi quando seminate a 500,000-600,000 fiasco cells/75mm. Queste cellule si differenziano facilmente con la rimozione di basicFGF e B27 e la presenza di FBS 1-2% e 1% insulina / Transferrina / selenio, e diventerà TUJ1 (Covance) neuroni positiva entro 14-21 giorni (vedi Figura 2). Il rapporto tra i neuroni alle cellule totali in un range tra 40-60%, dipende dall'età della cultura (Figura 3). I neuroni possono essere utilizzati per la sperimentazione di 12 giorni post-semina con almeno 21 giorni dopo la semina. <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Microfotografia di AGS adulto cellule staminali neurali dell'ippocampo. Microfotografia fase di adulti AGS cellule staminali neurali dell'ippocampo dopo 3 giorni di crescita in agsNSC dei media basale in fiaschi rivestiti Poli-L-ornitina. Raddoppio avviene circa ogni 24 ore. Foto con ingrandimento 100X. <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Micrografia fluorescente differenziate adulte AGS cellule staminali neurali dell'ippocampo AGS cellule staminali neurali sono stati sottoposti a mezzi di differenziazione per 4 giorni, poi mantenuto nella Neuralife per 17 giorni in più prima della posa. Le cellule sono state fissate con paraformaldeide 4% e neuroni identificati mediante TUJ1 anticorpo primario (Covance) e Alexa Fluor 568 anticorpo secondario (verde) da Invitrogen. Colorante Hoechst 33343 è stato aggiunto a macchia di tutti i nuclei (blu). Numero di cellulare, numero neurone e neurone rapporto sono stati determinati utilizzando il software neuriti escrescenza e lo strumento Arrayscan da Cellomics. Questa foto rappresenta circa il 57% dei neuroni. Ingrandimento 10X <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Numero di neuroni e Ratio Neuron di AGS differenziate le cellule staminali neurali a trecultura età AGS cellule staminali neurali sono stati sottoposti a mezzi di differenziazione per 4 giorni, poi mantenuto nella Neuralife per i giorni 12, 15 e 17 prima della posa. Le cellule sono state fissate e neuroni identificati con TUJ1 anticorpo primario (Covance). Hoechst colorante è stato aggiunto a macchia tutti i nuclei per l'identificazione delle cellule totali. Numero di cellulare, numero neurone e neurone rapporto percentuale sono stati determinati utilizzando il software neuriti escrescenza e lo strumento Arrayscan da Cellomics. Valori rappresentano media di 15 pozzi per condizione + SD. Tabella 1. Esempi di calcolo utilizzato in passaging e semina <ol><li> Utilizzando 700.000 cellule / ml sospensione cellulare </li><li> Utilizzando una densità cellulare di 75.000 cellule / ml o 15.000 cellule per pozzetto di 0,2 ml in ciascun pozzetto. </li><li> Inoculando 96 pozzetti a 0,2 ml per pozzetto = 19,2 ml o desiderato volume finale 21 ml. </li><li> (Volume finale x concentrazione finale) ÷ concentrazione iniziale = volume iniziale (21 ml x 75.000 cellule / ml) ÷ 700000 = 2,25 ml </li><li> Volume di FBS in sospensione cellulare. 2,25 ml = 2,25 ml x 0,05 = 0,1125 mL </li><li> Volume di FBS necessaria in 21 ml = 21 ml x 0,02 = 0,42 ml </li><li> Volume di FBS da aggiungere a Media Differenziazione = 0,42 ml - 0,1125 ml = 0,3075 mL </li><li> Volume del mezzo di differenziazione = 21 ml - 2,25 ml di sospensione cellulare - 0,3075 ml 5% FBS = 18,44 ml. </li><li> Combina 18,44 Media Differenziazione ml con FBS 0,308 ml e aggiungere 2,25 ml di sospensione cellulare. </li></ol>

<ol><li>Barnes, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+avoidance+in+a+mammal%3A+body+temperatures+below+0+degree+C+in+an+Arctic+hibernator%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator.</a> Science. 244, 1593-1595 (1989).</li>
<li>Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arctic+ground+squirrel+brain+is+resistant+to+injury+from+cardiac+arrest+during+euthermia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">The Arctic ground squirrel brain is resistant to injury from cardiac arrest during euthermia.</a> Stroke. 37, 1261-1265 (2006).</li>
<li>Dave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+epsilon+activation+delays+neuronal+depolarization+during+cardiac+arrest+in+the+euthermic+arctic+ground+squirrel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C epsilon activation delays neuronal depolarization during cardiac arrest in the euthermic arctic ground squirrel.</a> J Neurochem. 110, 1170-1179 (2009).</li>
<li>Ross, A. P., Christian, S. L., Zhao, H. W., Drew, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+tolerance+to+oxygen+and+nutrient+deprivation+and+N-methyl-D-aspartate+in+cultured+hippocampal+slices+from+hibernating+Arctic+ground+squirrel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Persistent tolerance to oxygen and nutrient deprivation and N-methyl-D-aspartate in cultured hippocampal slices from hibernating Arctic ground squirrel.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1148-1156 (2006).</li>
<li>Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arctic+ground+squirrel+%28Spermophilus+parryii%29+hippocampal+neurons+tolerate+prolonged+oxygen-glucose+deprivation+and+maintain+baseline+ERK1%2F2+and+JNK+activation+despite+drastic+ATP+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Arctic ground squirrel (Spermophilus parryii) hippocampal neurons tolerate prolonged oxygen-glucose deprivation and maintain baseline ERK1/2 and JNK activation despite drastic ATP loss.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1307-1319 (2008).</li>
<li>Jin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+stroke-induced+neurogenesis+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13198-13202 (2006).</li>
<li>Maysami, S., Lan, J. Q., Minami, M., Simon, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+progenitor+cells%3A+a+required+cellular+element+for+induction+of+ischemic+tolerance+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Proliferating progenitor cells: a required cellular element for induction of ischemic tolerance in the brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1104-1113 (2008).</li>
<li>Sung, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2Freoxygenation+stimulates+proliferation+through+PKC-dependent+activation+of+ERK+and+Akt+in+mouse+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/reoxygenation stimulates proliferation through PKC-dependent activation of ERK and Akt in mouse neural progenitor cells.</a> Neurochem Res. 32, 1932-1939 (2007).</li>
<li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci Methods. 71, 143-155 (1997).</li>
<li>Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+rat+hippocampus+contains+primordial+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells.</a> Mol Cell Neurosci. 8, 389-404 (1997).</li>
</ol>

JA Kelleher-Andersson è il fondatore di Neuronascent ed è l&#39;inventore delle applicazioni scoiattolo di terra di brevetto Artico. Neuronascent riceve royalties sulla vendita di AGS media e cellule staminali. RC McGee è un dipendente Lifeline, Inc. che distribuisce le cellule staminali neurali media e AGS.

AGS cellule staminali adulte neurali sono robusti e può essere ampliato per numerosi passaggi che li rende una fonte eccellente di cellule staminali neurali per lo studio delle proprietà delle cellule staminali neurali di base. Il tasso di espansione è di circa un raddoppio ogni 24 ore, ma queste cellule devono essere diversi passaggi prima di confluenza raggiungere perché il contatto tra le cellule favorirà la differenziazione di astrociti. Contatto mediato differenziazione quindi causa il rapporto tra i neuroni al num...

<table><tbody><tr><td>agsNSC</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>FC-0004</td><td></td></tr><tr><td>Kit di espansione agsNSC</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0008</td><td>Fonte alternativa per DMEM/F12, B27 e rhFGFb (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Kit di differenziazione agsNSC</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0009</td><td>Fonte alternativa per DMEM/F12 e ITS-x (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Kit di mezzi di mantenimento NeuraLife</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0012</td><td>Fonti alternative sono NeuraBasal (LifeLine) o Neurobasal (in vitrogen), glutammina e B27 (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;) Le cellule differenziate vengono mantenute fino a 3 settimane in NeuroLife, ma non più di 2 settimane in Neurobasal (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Micrometro (ad esempio una camera di conteggio Bright Line)</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Piastre da 96 pozzetti rivestite con poli-L-lisina Biocoat</td><td>BD Biosciences</td><td>356516</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bdbiosciences.com">www.bdbiosciences.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Punte di pipetta con orifizio largo</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-141</td><td>Evita danni alle cellule neuronali durante la pipettaggio. &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com">http://www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

crescita e la differenziazione degli adulti ippocampale suolo artico cellule staminali neurali squirrel

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Scoiattoli artici (Urocitellus parryii, AGS) sono unici nella loro capacità di letargo con una temperatura interna del corpo vicino o sotto lo zero 1. Questi animali anche resistere al danno ischemico cerebrale in vivo 2,3 e deprivazione di ossigeno e glucosio in vitro 4,5. Queste qualità uniche fornito l&#39;impulso di isolare i neuroni AGS di esaminare le caratteristiche intrinseche dei neuroni che potrebbe spiegare la capacità dei neuroni AGS a resistere lesioni e la morte cellulare causata da ischemia e temperature estremamente fredde. L&#39;identificazione delle proteine ​​o obiettivi gene che consentono le proprietà distintive di queste cellule potrebbero essere di aiuto nella scoperta di terapie efficaci per una serie di indicazioni ischemica e per lo studio della resistenza al freddo. Adulto ippocampo AGS contiene cellule staminali neurali che continuano a proliferare, consentendo una facile espansione di queste cellule staminali in coltura. Descriviamo qui i metodi con cui i ricercatori possono utilizzare queste cellule staminali e neuroni differenziati per qualsiasi numero di scopi. Da seguire con attenzione questi passaggi il neurali cellule staminali AGS può essere espansa attraverso due o più passaggi e poi differenziato a una cultura ad alto contenuto di TUJ1-positivi neuroni (~ 50%) senza utilizzare sostanze chimiche tossiche per minimizzare il numero di cellule in divisione. Ischemia induce neurogenesi 6 e neurogenesi che procede attraverso MEK / ERK e percorsi di sopravvivenza PI3K/AKT segnalazione contribuisce alla resistenza ischemia in vivo in vitro 7 e 8 (Kelleher-Anderson, Drew et al., In preparazione). Un&#39;ulteriore caratterizzazione di queste cellule neurali unica possibile anticipo su molti fronti, utilizzando alcuni o tutti questi metodi.

Cellule staminali neurali sono stati preparati da ippocampo di adulti non-letargo yearling scoiattoli artici (AGS). Queste cellule staminali neurali può essere espansa attraverso numerosi passaggi, differenziate e mantenuto come un neurone quasi 50:50 alla cultura gliali.

Crescita e la differenziazione degli adulti ippocampale suolo artico Cellule Staminali neurali Squirrel

I scoiattoli terrestri dell'Artico (Urocitellus parryii, AGS) sono unici per la loro capacità di ibernarsi con una temperatura corporea centrale prossima o inferiore al punto di congelamento 1. Questi...

L'obiettivo generale di questa procedura è seminare, espandere e differenziare cellule staminali neurali ottenute dall'ippocampo di scoiattoli terrestri artici adulti di un anno non ibernanti. Questo viene realizzato innanzitutto seminando le cellule staminali neurali di A GS. Successivamente, espandere e seminare le cellule staminali neurali in un mezzo di differenziazione.Il terzo passaggio della procedura consiste nel differenziare e mantenere i neuroni, e infine le cellule vengono fissate o trattate e fissate per l'analisi. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano come i progenitori neuronali GS continuino a dividersi per due settimane di differenziazione, mantenimento e persino in condizioni ischemiche. Il numero di neuroni viene determinato mediante tecniche di colorazione e microscopia fluorescente che misurano i rapporti neuronali.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla scoperta di terapie per ictus e arresto cardiaco. Poiché i neuroni differenziati dello scoiattolo terrestre artico sono tolleranti a tutti gli insulti ischemici, prima di iniziare questa procedura, preparare il flacone da utilizzare per l'espansione di A-G-S-N-S-C rivestendolo con poliornitina. Lasciare la soluzione lavorativa di poliornitina nell'incubatore.Dopo lo scongelamento, la soluzione può essere conservata fino a un mese a due-otto gradi Celsius. Aggiungere otto millilitri di soluzione working di poliolo ornitina in un fiasco T 75 ventilato e distribuire uniformemente la soluzione su tutta la superficie di coltura del fiasco. Incubare il fiasco a 37 gradi Celsius per un minimo di 24 ore, preferibilmente in un incubatore senza CO2 aggiunta prima dell'uso.Aspirare la soluzione operativa di poliolo ornitina dal pallone e lavare due volte con acqua sterile per colture cellulari. Aspirare il liquido fino a quando il pallone è quasi asciutto prima di utilizzarlo per scongelare e seminare cellule staminali neurali di scoiattolo terrestre artico. Per prima cosa, rimuovere una provetta di A-G-S-N-S-C dal contenitore di azoto liquido e verificare che il tappo della provetta sia ben sigillato.Tenere la parte superiore della provetta lasciandone la metà inferiore in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per circa 60-90 secondi. Mantenere il tappo della provetta fuori dall'acqua per evitare possibili contaminazioni. Rimuovere la provetta dal bagno d'acqua quando è quasi completamente scongelata.Dovrebbe essere ancora visibile una piccola quantità di ghiaccio. Non scongelare eccessivamente, poiché ciò potrebbe danneggiare le cellule. Spruzzare l'esterno della provetta con etanolo al 70% o isopropanolo, quindi portare la provetta all'interno di una cappa a sicurezza biologica.Rimuovere con attenzione il tappo per evitare contaminazioni o schizzi. Utilizzando una pipetta sterile, aggiungere un millilitro di mezzo basale nel flacone e risospendere delicatamente.Sospendere le cellule. Trasferire le cellule risospese in 25 millilitri di mezzo basale tiepido in un tubo da centrifuga da 50 millilitri. Centrifugare le cellule a 150 ×g per sei minuti mentre le cellule si sedimentano.Aggiungere 10 millilitri di mezzo di espansione nel flacone T 75 rivestito con poli-L-ornitina secco, quindi aggiungere 40 microlitri di Rh FGF basic al termine della centrifugazione. Aspirare con attenzione il sopranatante e il liquido senza aspirare il pellet. Sospendere le cellule in 10 millilitri di mezzo di espansione.Trasferire le cellule sospese nel mezzo presente nella fiasca T 75. Agitare delicatamente la fiasca da un lato all'altro per distribuire uniformemente le cellule all'interno del contenitore. Posizionare la fiasca seminata in un incubatore a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5%.Le cellule dovrebbero aderire alla fiasca e iniziare a formare prolungamenti entro due ore dal seeding, effettuato il giorno successivo all'inoculazione. Aggiungere alla fiasca di A-G-S-N-S-C 40 microlitri di Rh FGF basic. A due giorni dal scongelamento e dal seeding delle cellule, effettuare un completo cambio di mezzo utilizzando 20 millilitri di mezzo di espansione più un'aggiunta di 40 microlitri di RH FGF basic, al terzo o quarto giorno dopo l'inoculazione.Il A-G-S-N-S-C dovrebbe essere passato aspirando il mezzo per la fiasca T75 e aggiungendo 2,5 millilitri di tripsina EDTA, quindi agitare delicatamente per assicurarsi che tutte le cellule siano ricoperte dalla tripsina. EDTA e battere leggermente il contenitore di coltura da diversi lati per favorire il distacco. Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere 10 millilitri di mezzo basale alla fiasca, agitare delicatamente per assicurarsi che tutta la soluzione di tripsina sia neutralizzata.Trasferire le cellule con una pipetta in un tubo da centrifuga sterile contenente 10 millilitri di mezzo basale. Lavare quindi la fiasca con ulteriori 10 millilitri di mezzo basale e unire al primo lavaggio; centrifugare le cellule a 150 ×g per sei minuti. Dopo la centrifugazione, le cellule dovrebbero formare un pellet pulito e sciolto; aspirare il soprannatante dal tubo da centrifuga.Quindi, utilizzando una pipetta da 10 millilitri, aggiungere 10 millilitri di mezzo basale preriscaldato e risospendere. Risospendere il pellet cellulare pipettando delicatamente su e gi&ugrave; due volte. Se questo metodo viene seguito attentamente, &egrave; possibile prevedere un rendimento di tre o pi&ugrave; raddoppiamenti, ottenendo una popolazione di oltre 4 milioni di cellule a partire da un numero iniziale di circa 500.000. Illustreremo l'inoculo di A-G-S-N-S-C in una piastra a 96 pozzetti rivestita con poli-L-lisina per la differenziazione, anche se qualsiasi formato a pozzetti multipli pu&ograve; essere utilizzato per questa procedura.Per prima cosa, determinare il volume di sospensione cellulare necessario per il proprio esperimento e la quantità di FBS da aggiungere al mezzo di differenziazione A-G-S-N-S-C per ottenere una concentrazione finale di FBS al 2%. Un esempio di questi calcoli è riportato nel testo del protocollo successivo all'interno di una cappa a sicurezza biologica. Mescolare il FBS e il mezzo di differenziazione.Quindi mescolare delicatamente le cellule con un volume calcolato di mezzo di differenziamento contenente FBS e trasferire le cellule nel mezzo in un serbatoio sterile per punte combinate. Utilizzando una pipetta multicanale e punte con orifizio largo, distribuire 200 microlitri di sospensione cellulare diluita dal serbatoio in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti rivestita con poli-L-lisina; incubare la piastra da un'ora e mezza a due ore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, per consentire l'adesione delle cellule. Il mezzo.La sostituzione del mezzo può rappresentare una fase delicata di questa tecnica, poiché l'uso di punte di pipetta di dimensioni standard potrebbe danneggiare le cellule. Per questo motivo, si utilizzano punte di pipetta con orifizio largo per evitare di danneggiare le cellule durante la sostituzione del mezzo. Quando le cellule si sono attaccate, rimuovere con attenzione il 50%, ovvero 100 microlitri in questo caso, del mezzo da ciascun pozzetto utilizzando punte di pipetta con orifizio largo.Sostituire con attenzione il volume rimosso con mezzo di differenziamento tiepido, utilizzando nuovamente punte di pipetta con orifizio largo. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, due giorni dopo l'inoculazione.Eseguire un cambio del 50% del mezzo utilizzando punte di pipetta con orifizio medio, medio-grande o grande. Il mezzo di mantenimento neuronale per la conservazione dei neuroni deve essere preparato settimanalmente seguendo le istruzioni del produttore. Due giorni dopo l'ultima differenziazione. Cambio del mezzo. Eseguire un rimpiazzo del 50% del mezzo utilizzando il mezzo di mantenimento neuronale. Rimuovere con attenzione 100 microlitri del mezzo di differenziazione da ogni pozzetto mediante punte di pipetta ad ampio orifizio e sostituire con 100 microlitri di mezzo di mantenimento neuronale. Continuare a effettuare ricambi del 50% del mezzo utilizzando il mezzo di mantenimento neuronale ogni due o tre giorni. I processi neuronali dovrebbero apparire entro pochi giorni dal passaggio al mezzo di mantenimento neuronale. Le cellule devono essere utilizzate entro tre settimane dal trasferimento nel mezzo di mantenimento neuronale.Medium di coltura per scoiattolo terrestre artico. Le cellule staminali neurali adulte raddoppieranno ogni 24 ore per tre-cinque giorni per almeno due passaggi quando seminate a una densità di 500.000-600.000 cellule per fiala da 75 centimetri quadrati. Questa microfotografia a 100x mostra cellule staminali neurali dell'ippocampo di un adulto GS dopo tre giorni di crescita in A-G-S-N-S-C.I mezzi basali nei flaconi rivestiti con poliolo e ornitina, insieme a FBS e FGF basico RH, vengono rimossi. Le cellule staminali neurali di tipo A si differenzieranno in circa metà neuroni e metà astrociti. I neuroni risulteranno positivi per Tuj1 entro 14-21 giorni, come illustrato da questa microfotografia a fluorescenza.Qui, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% e i neuroni identificati in verde. Utilizzando un anticorpo primario TJ e un anticorpo secondario LOR 5 68, tutti i nuclei sono stati colorati in blu mediante l'aggiunta del colorante Hoechst. Il rapporto tra neuroni e cellule totali varierà dal 40 al 60%, a seconda dell'età della coltura.Questo grafico mostra il numero di neuroni e i rapporti tra neuroni differenziati da cellule staminali neurali di scoiattolo artico a 16, 19 e 21 giorni dall'inoculazione. Per la differenziazione, i neuroni possono essere utilizzati per esperimenti a partire da 12 giorni dopo il seeding fino ad almeno 21 giorni dopo il seeding. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare neuroni di scoiattolo artico per l'uso in esperimenti di ischemia.

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Questo video dimostra il processo di formazione delle neurosfere e la loro espansione dal tessuto ippocampale. Le cellule staminali neurali e le cellule progenitrici del tessuto del giro dentato postnatale del topo proliferano e formano neurosfere primarie, che vengono poi riseminate per formare neurosfere secondarie.

Formazione ed espansione di neurosfere da un tessuto ippocampale

Cellule staminali neurali raccolte dal cervello adulto sono in aumento utilizzati in applicazioni che vanno dalla ricerca di base dello sviluppo del sistema nervoso ad esplorare potenziali applicazioni cliniche in medicina rigenerativa. Questo rende rigoroso controllo delle condizioni di isolamento e di coltura utilizzate per coltivare queste cellule fondamentali per suonare i risultati sperimentali.

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Qui si descrive un protocollo dettagliato per la generazione simultanea di colture di cellule precursore neuronali, sia come monostrati aderenti o neurosfere, dalla zona subventricolare e giro dentato di singoli topi adulti.

Un mouse, due culture: isolamento e la coltura di Adult Neural Stem Cells dalle due zone neurogena Mice individuale

Questo articolo video illustra un protocollo completo per rilevare e quantificare tutte le fasi della neurogenesi ippocampale adulta all'interno della stessa sezione di tessuto. Abbiamo elaborato un metodo per superare i limiti dell'immunofluorescenza multipla indiretta che si verificano quando non sono disponibili anticorpi adatti da diverse specie ospiti.

Immunoistochimica e multiplo etichettatura con anticorpi delle specie ospite stessi allo Studio adulti ippocampale neurogenesi

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Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

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Presentato qui è un protocollo per la generazione spontanea di neurosfere arricchite in cellule progenitrici neurali da neuroni placcati ad alta densità. Durante lo stesso esperimento, quando i neuroni sono placcati ad una densità inferiore, il protocollo si traduce anche in colture di neuroni ratti primari prolungati.

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