Profilatura di pre-micro-RNA e microRNA con Quantitative Real-time PCR (qPCR) Array

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di consentire una configurazione automatizzata rapida e affidabile degli array basati su QPCR. Ciò si ottiene preparando prima i set di primer per l'array e impostando le miscele master del campione da selezionare. Successivamente, viene utilizzata una configurazione robotica automatizzata di PCR o un sistema di pipette elettroniche a matrice per campionare con precisione Eloqua la miscela master e i set di primer in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti.

Una volta preparate, le reazioni PCR a 384 pozzetti vengono eseguite con il programma PCR basato su cyber cycler four 80. La fase finale della procedura consiste nell'analizzare i dati della QPCR e determinare i livelli di espressione relativi per ciascuna coppia di primer testata, ognuno dei quali ha come bersaglio uno specifico mRNA. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano cambiamenti nell'espressione di grandi insiemi di mRNA.

Gli array sviluppati in modo specifico possono quindi mirare a interi profili di pre micro RNA, percorsi specifici o molecole chiave per l'infezione virale attraverso la profilazione basata sulla QPCR. Ciao, sono Dirk DMA del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill. Oggi ti mostreremo come impostare QQPC rra in tempo reale e ti mostreremo due metodi.

Uno, utilizzando una pipetta irregolare e uno utilizzando un robot. Utilizziamo questa tecnologia per misurare i pre microRNA e i microRNA maturi nei tumori umani. La manifestazione di oggi sarà fatta da Pauline Chu e Kristen bu.

Quindi iniziamo. Per iniziare questa procedura, recuperare le piastre di innesco contenenti 186 coppie di innesco in un 96. Formattare bene a 0,5 picaMole conservato a meno 20 gradi Celsius.

Dopo aver scongelato le piastre a temperatura ambiente, agitarle e centrifugarle brevemente. Inoltre, scongelare il cyber green due volte la miscela PCR a temperatura ambiente per l'impostazione di ciascuna piastra di primer a 96 pozzetti, saranno necessarie quattro provette di miscelazione master. Preparare la miscela master combinando quattro microlitri di miscela di verde cibernetico, tre microlitri di acqua di grado PCR e da 10 a 20 nanogrammi di campione di DNA o CDNA per reazione in ciascuna delle quattro provette einor da due millilitri.

Ogni provetta deve contenere una quantità sufficiente di master mix per circa 100 reazioni, consentendo l'eccesso per gli scarti di pipettaggio. Agitare i tubi einor per mescolare. Iniziare la configurazione del saggio del micro RNA precursore utilizzando il robot Tecan EVO con inizializzazione del robot e caricamento del programma di usura EVO.

Quindi lavare il robot tre volte con 30 millilitri di liquido di sistema per eliminare il sistema dalle bolle d'aria che interferiranno con la precisione del pipettaggio. Successivamente, configurare la piattaforma del robot in modo da includere una piastra da 384 pozzetti e una piastra di innesco da 96 pozzetti. Il master mescola una vasca contenente il 2% di candeggina, un sistema riempito, un contenitore per liquidi e un contenitore per rifiuti vuoto.

Avvia l'esecuzione automatizzata del robot selezionando Esegui due volte alla fine del programma. Rimuovere la piastra a 384 pozzetti e sigillarla con un ciclatore a quattro fogli da soffitto 80. Quindi centrifugare la piastra.

Posizionare brevemente la piastra sigillata a 384 pozzetti nella posizione uno dell'hotel. Quindi ripetere questo processo per la piastra di primer due con nuove miscele master e una nuova piastra a 384 pozzetti. Posizionare la targa del mondo 384 sigillata risultante nella posizione due dell'hotel.

Aprire un nuovo programma di usura EVO per caricare il light cycler dall'hotel e impostare i parametri del ciclo. Quindi seleziona Esegui due volte. Freedom Evo caricherà automaticamente ogni piastra nel light cycler ed eseguirà il programma di ciclismo HRM cyber green one.

Una volta completato. Rivedere e analizzare i risultati come descritto nel protocollo scritto in alternativa all'utilizzo del robot. Una pipetta elettronica multicanale a matrice può essere utilizzata per iniziare a posizionare il contenuto della provetta di miscelazione master in un serbatoio.

Impostare la pipetta elettronica per aspirare 16 microlitri di master mix con due fasi di erogazione da otto microlitri seguite da una fase di spurgo. Dopo aver impostato la pipetta, aspirare 16 microlitri di master mix e iniziare a erogare in una piastra a 384 ruote. Erogare i primi otto microlitri a righe alterne della colonna uno utilizzando le righe da A a O, lasciando vuota la colonna successiva.

Erogare i secondi otto microlitri nelle stesse file della colonna tre. Quindi spurgare su un contenitore di rifiuti e smaltire le punte seguendo questo schema di lasciare righe e colonne alternate. Erogare attraverso la piastra per altri cinque cicli per pipettare la miscela master due.

Utilizza le stesse righe del mix principale uno, ma inizia con la colonna due. Ripetere questa procedura per le master mix tre e quattro, iniziando rispettivamente dalle colonne uno e due, ma questa volta utilizzando la rosa B per la quotazione P.Her della piastra di innesco. Impostare una pipetta elettronica per aspirare due microlitri ed erogare due microlitri con una fase di spurgo da seguire.

Trasferire due microlitri di primer dalla colonna una fila A a H di una piastra di primer da 96 pozzetti a ogni altra colonna di canottaggio una delle piastre da 384 pozzetti, spurgare su un contenitore di rifiuti e smaltire i puntali. Ripetere questo schema per il quatt primer per le tre miscele master rimanenti delle colonne uno e due. Quindi continuare questo processo per le colonne da due a 12 della piastra di primer a 96 pozzetti, spostandosi ogni due colonne nella piastra a 384 pozzetti per ciascuna colonna di primer.

Quindi, sigillare le piastre con un light cycler a soffitto, un foglio e una centrifuga. Breve dopo la centrifugazione. Posizionare le piastre in un light cycler quattro 80 e ciclare le piastre utilizzando il formato di rilevamento HRM verde cibernetico.

Utilizzando le stesse condizioni cicliche di prima, ripetere questa procedura utilizzando la piastra di primer due Eloqua in una piastra fresca a 384 pozzetti utilizzando miscele master appena preparate. Le firme dei micro RNA precursori emergono attraverso la profilazione utilizzando un nuovo array basato su QPCR. È stata calcolata la TC delta media normalizzata a U 6 e i valori standardizzati sono stati caricati nell'array.

Software minore che produce tre cluster distinti visualizzati come mappe di calore. L'espressione relativa di ciascun micro RNA precursore è mostrata in rosso e blu che rappresentano rispettivamente un aumento e una diminuzione dell'espressione relativa. L'intensità del colore indica il grado di variazione dell'espressione.

La maggior parte dei microRNA precursori ha subito piccoli cambiamenti insignificanti come previsto. Tuttavia, una piccola parte dei microRNA precursori è aumentata significativamente durante l'esperimento. Inoltre, il livello relativo di alcuni microRNA precursori è diminuito drasticamente.

In alcuni casi. Si raggruppano anche nell'analisi della mappa di calore. A seconda dell'esperimento, possono emergere cluster che dipendono dall'infezione virale, dall'espressione specifica del tipo di cellula di microRNA precursori o da microRNA precursori regolati da una molecola comune o da una via di segnalazione.

Vengono mostrate le soglie medie del ciclo o cts di un campione negativo per l'herpes virus associato al sarcoma di Posey che esegue un duplicato quad. È importante sottolineare che l'antigene nucleare associato alla latenza del virus dell'herpes di Kaposi o KSHV Lana non è stato rilevato in questo campione dall'array QPCR altamente sensibile. Tuttavia, sia il controllo interno U sei che il let sette un micro RNA precursore umano altamente espresso, sono stati espressi a livelli rilevabili.

Infine, come previsto, il controllo negativo dell'acqua di grado PCR non ha prodotto il prodotto A-Q-P-C-R. Un'analisi della curva di fusione per due diversi primer. Viene mostrato l'utilizzo dello stesso duplicato di campionamento.

È chiaro che la temperatura di fusione è diversa per le due coppie di primer, ma il campione sta fondendo alla stessa identica temperatura per ogni replica. I segni di un campione difettoso o potenzialmente contaminato possono includere diversi picchi di fusione che suggeriscono la presenza di due diverse fonti di input. Ti abbiamo appena mostrato come impostare un esperimento QPCR in tempo reale utilizzando un robot.

È importante includere tutti i controlli e il maggior numero possibile di geni per la pulizia. Quindi grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.