Name: Resezione del nervo ottico: un modello di apoptosi Neuron adulti nel Sistema Nervoso Centrale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Scopri la resezione del nervo ottico come modello riproducibile di apoptosi neuronale nel sistema nervoso centrale adulto. Questo metodo permette di studiare la morte cellulare delle cellule gangliari retiniche e valutare strategie neuroprotettive.

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1. Tecnica chirurgica <ol><li> Gli esperimenti deve essere effettuata usando tecniche asettiche e seguendo i protocolli di uso di animali della vostra istituzione specifica. Strumenti e materiali (soluzioni, sostanze in esame, traccianti, aghi, ecc), entrando in contatto con tessuti vivi, devono essere sterili per prevenire l'infezione e impatti negativi sul benessere degli animali e il potenziale impatto negativo sullo studio. </li></ol> 2. Anestesia <ol><li> I ratti saranno anestetizzati con un sistema veterinario vaporizzatore isoflurano. Usare l'ossigeno per uso medico a una velocità di 0,8 L / min per vaporizzare il gas isoflurano. Posto l'animale nella casella di anestesia attaccato e comporre in una concentrazione di isoflurano del 4% fino a quando il respiro si è rallentato e l'animale è calmo. </li><li> Quindi, interruttore il flusso di gas per l'attaccamento maschera antigas per il telaio stereotassico e posto l'animale in dell'apparato stereotassico. Girare la concentrazione di isofluorano al 2% e monitorare l'anestesia. Animali più grandi (&gt; 300g) può richiedere una maggiore concentrazione di isoflurano. L'anestesia deve essere monitorata durante l'intervento chirurgico e il dosaggio isoflurano aggiustato di conseguenza. La profondità e la velocità di respirazione deve essere costantemente valutata e un pizzico di valutazione tep (ogni 5 minuti) per l'assenza di dolore profondo deve essere eseguito. </li><li> Una volta che l'operazione è completata, spegnere l'isoflurano e permettere all'animale di respirare ossigeno per alcuni minuti prima della rimozione dal dispositivo stereotassico. La temperatura corporea deve essere mantenuta coprendo l'animale con una coperta chirurgico e / o utilizzando una coperta riscaldamento regolabile durante l'intervento. </li></ol> 3. Approccio chirurgico <ol><li> Bagnare il pelo sulla parte superiore della testa con il 70% di etanolo per rendere il pelo più facile da tagliare. Rimuovere la pelliccia dal mezzo agli occhi con un clipper o forbici taglienti. Pulire l'area di incisione per tre volte con applicazioni alternate di soluzione di iodio detergente (Proviodine, Betadine, ecc), seguito da etanolo al 70%. Mantenere la cornea umida per tutta la chirurgia dell'occhio applicando pomata oftalmica (Tears Naturale PM) alla cornea. Stendere l'unguento sulla superficie della cornea manualmente l'apertura e la chiusura delle palpebre. </li><li> Utilizzando una lama n ° 11, fare un'incisione lungo la linea mediana della testa di circa 0,5 cm davanti agli occhi a 1 cm dietro gli occhi. Ritrarre il lembo di pelle sopra l'occhio con pinze e delicatamente stuzzicare via il tessuto connettivo sottostante, con la parte posteriore del bisturi. Poi, ritirare il lembo di pelle lateralmente e verso il basso e tenere in posizione con un divaricatore chirurgico che può essere registrata alla base dello strumento stereotassico. </li><li> Fare un'incisione lungo il bordo superiore dell'osso orbitale mentre si tira su la fascia sovrastante con una pinza tagliente. Questo ritirerà la fascia sovrastante l'orbita dell'occhio. Il bordo dell'osso orbitale può essere chiaramente delimitato utilizzando pinze a spingere verso il basso la fascia sovrastante l'orbita. Utilizzando un dispositivo di cauterizzazione o bisturi, continuare l'incisione a ritroso verso il limite posteriore dell'orbita dell'occhio. Utilizzare l'osso dell'orbita superiore come una guida per l'incisione. Avanti continuare l'incisione in avanti verso il limite anteriore dell'orbita. L'incisione dell'orbita superiore è meglio farlo con un piccolo dispositivo cauterizzazione al fine di prevenire le emorragie dai vasi sottostanti che comunicano con i seni venosi. </li><li> Se l'emorragia si verifica diversi passaggi possono essere prese. In primo luogo, applicare una pressione utilizzando tamponi sterili chirurgici o tamponi di cotone. Se l'emorragia continua, si applica a freddo, sterile, soluzione salina tampone fosfato (PBS) per l'area con un contagocce, e mantenere la pressione. Sanguinamenti minori si fermerà dopo alcuni secondi con questa procedura. Se il sanguinamento persiste, applicare la trazione ai tessuti con il tampone chirurgico o tampone di cotone al fine di identificare la fonte di sanguinamento e rapidamente cauterizzare la nave compromessa. Dopo che il sanguinamento è contenuto, utilizzare freddo PBS sterile per pulire l'area chirurgica di sangue. L'area chirurgica dovrebbe essere periodicamente puliti in questo modo al fine di visualizzare meglio le strutture nell'orbita dell'occhio. </li><li> Una volta che l'incisione è stata pulita, utilizzare forcipe e la parte posteriore del bisturi per pulire il tessuto connettivo nella parte posteriore dell'occhio che ricopre il contenuto orbitale. Il retro del n. 11 bisturi funziona bene come la punta va bene. Si aprirà porzioni più profonde della cavità orbitale che fornisce una finestra più grande chirurgico per lavorare in Usa 7b Dumont # sharp-curve-seghettato pinze quando si lavora in un occhio come il loro curvatura e suggerimenti multa sono ideali per la manipolazione di strutture in orbita. Inoltre, le scanalature aiutano con le strutture di presa. </li><li> Quindi, rimuovere il tessuto connettivo che circonda la branca oftalmica del nervo trigemino che si trova nei pressi della linea mediana, e rimuovere il nervo utilizzando pinze. Questo passaggio non è necessario, tuttavia la rimozione del nervo fornirà una finestra più grande di accessos al nervo ottico in seguito. </li><li> Dopo la rimozione del nervo, usare il forcipe per ritirare il vaso sanguigno sotto e completamente cauterizzare la nave. Questo passo non è inoltre necessario, tuttavia cauterizzazione del vaso permette di essere spostato anteriormente, creando così una finestra più grande una volta che il nervo ottico viene raggiunto. </li><li> Utilizzare un paio di pinze taglienti, pinze o che hanno avuto le loro punte piegate verso l'interno per scegliere bene e togliere il sottile strato di tessuto connettivo sui muscoli extraoculari e la ghiandola lacrimale. Ritrarre i muscoli oculari extra da anteriore a posteriore dell'orbita. Afferrare la parte prossimale del muscolo con un paio di pinze e usare un secondo paio di pinze curve vestirsi occhio seghettata per applicare la trazione verso l'esterno sul muscolo. Assicurarsi che la pinza occhio spogliatoio sono orientate nella stessa direzione in cui tira il muscolo, per evitare strappi. Rimuovere il muscolo più anteriore dell'orbita (obliquo superiore) in questo modo. Il muscolo verrà liberato dal profondo l'orbita e la lunghezza rimanente può essere ritratto in modo da ruotare l'occhio verso l'esterno. </li><li> Ripetere il passaggio con il muscolo 3,8 successivo (retto mediale) che si trova tra i lobi della ghiandola lacrimale e Gland Harderian vicino alla linea mediana della superficie dorsale dell'occhio. Nastro lungo il divaricatore per mantenere la trazione sui muscoli. </li><li> Rimuovere delicatamente qualsiasi tessuto connettivo rimanenti sulla superficie della ghiandola lacrimale e sollevare la ghiandola verso l'alto con pinze. Non comprimere o spremere la ghiandola. Al fine di ritirare la ghiandola, ma solo una nave unica al polo posteriore deve essere cauterizzato. Sollevare l'estremità posteriore della ghiandola verso l'alto, e poi cauterizzare la nave. </li><li> Successivamente, lembo della ghiandola lacrimale in avanti per aprire la parte posteriore dell'orbita e consentire il libero accesso ai muscoli che si sovrappongono al nervo ottico. Mantenere l'area costantemente umido con PBS sterile, e asciugatura con tamponi chirurgici o tamponi di cotone. </li><li> Utilizzando pinze taglienti ancora una volta, rimuovere il tessuto connettivo sottile che circonda i muscoli dell'orbita posteriore (elevatore della palpebra superiore e retto superiore) e separare i fasci del muscolo sottostante. Ritrarre i muscoli in modo indipendente o all'unisono, usando la curva seghettato Pinza medicazione occhio, ancora una volta, tirando in linea con le fibre muscolari. Fissare le lunghezze muscolari restanti, il riavvolgitore con i muscoli che sono stati ritratta nei passaggi 3.8 e 3.9 e nastro in basso, il riavvolgitore per applicare la trazione. Un totale di 4 muscoli sarà ora allegata al riavvolgitore. Questo ruoterà l'occhio in avanti e verso l'esterno al fine di rivelare la guaina che contiene grassi che circonda il nervo ottico. </li></ol> 4. Accesso al nervo ottico <ol><li> Utilizzare pinze taglienti (Fine punta Dumont) per tirare verso l'alto sul tessuto connettivo che circonda la guaina grassa del nervo ottico. Fare un taglio longitudinale con piccole forbici primavera Vännäs. Espandere il taglio, se necessario. Il grasso contenuto dalla guaina inizierà a gonfiarsi una volta il taglio è fatto. Avanti rimuovere i lembi di tessuto connettivo con attenzione tirando verso l'alto dal bordo e tagliare i lembi di tessuto a forma di mezzaluna. </li><li> Togliere il grasso sovrastante il nervo ottico utilizzando forcipe per tirare su il grasso, mentre il taglio con le forbici a molla il Vännäs. Mantenere l'area pulita utilizzando PBS sterile e tamponi chirurgici per pulire le piccole quantità di sangue che derivano dalla rimozione del tessuto. </li><li> Il nervo ottico è ora visibile. Per accedere al nervo, la guaina che circonda meningea il nervo deve essere rimosso senza danneggiare l'arteria oftalmica che alimenta la retina interna. Esaminare il motivo della guaina vascolare meningeo con pinze a ruotare delicatamente la guaina. Cercare una zona priva di vasi sanguigni e permettendo un taglio longitudinale da effettuare nel fodero meningea. </li><li> Utilizzando multa punta Dumont pinza, stringere la dura e tirare verso l'alto. Vicino alla base del cuneo di forma triangolare di durata che si crea, usare le forbici primavera Vännäs di fare una piccola incisione nel fodero. Inserire la lama inferiore della forbice nel incisione e taglio parallelo alla direzione guaina del nervo ottico, attenzione a non danneggiare la vascolarizzazione con tagli laterali. Utilizzare le pinze e forbici per coprire la dura su entrambi i lati del nervo ottico. </li><li> L'unica copertura rimanente del nervo è la membrana aracnoide. E 'molto sottile e trasparente. Al fine di determinare se la membrana è ancora presente, utilizzare pinze taglienti per pizzicare la superficie del nervo. E 'l'aracnoide è presente, pizzicare la membrana e tirare verso l'alto per creare un cuneo triangolare di tessuto. Fai una piccola incisione con la punta delle forbici simili alla Fase 4.4. Poi, inserire la lama inferiore delle forbici e fare un taglio longitudinale nella aracnoide. Successivamente, utilizzare le forbici e pinze a drappeggio l'aracnoide su entrambi i lati del nervo ottico. </li><li> Utilizzando una micro-surgancio gico, elevare il nervo ottico dalla guaina meningea. Passare la punta del gancio intorno al bordo esterno del nervo e assicurarsi che il gancio rimane in contatto con il nervo in modo che non cattura le membrane meningee con il gancio e accidentalmente transetto. Sollevare delicatamente il nervo ottico dalla guaina meningea e completamente transetto il nervo dietro il punto supportato dal gancio. Il moncone transected nervo ottico avrà ora un estremità libera, consentendo la rimozione del gancio. </li><li> Se il RGCs stanno per essere retrogrado etichettati al fine di quantificare la sopravvivenza, posto un piccolo pezzo di Gelfoam imbevuto nel 3% Fluorogold (o un altro tracciante retrogrado) sul ceppo transected nervo ottico (vedi <a href="https://www.jove.com/details.php?id=2261">JOVE protocollo 2261</a> ). </li></ol> 5. Di chiusura e recupero <ol><li> Alleviare la trazione sui muscoli oculari in più e tornare l'occhio ad una posizione neutra. Nel farlo, assicuratevi di spingere il Gelfoam giù nell'orbita dell'occhio per garantire che l'occhio non viene riportato in posizione, il Gelfoam rimane attorno al moncone del nervo ottico. Ritorna la ghiandola lacrimale e muscoli oculari in più per le loro posizioni naturali. </li><li> Restituire il lembo di pelle alla linea mediana e suturare la ferita. Applicare occhio pomata oftalmica in entrambi gli occhi. Poi, spegnere la fonte isoflurano e permettere all'animale di respirare ossigeno per alcuni minuti. Posto l'animale in una gabbia riscaldata o una gabbia sotto una lampada di calore per recuperare. Non appoggiare letto nella gabbia di recupero per eliminare la possibilità di aspirare letto durante il recupero. </li><li> Animali dovrebbero essere accolti in modo indipendente dopo l'intervento chirurgico. Messaggio analgesici chirurgici deve essere somministrato secondo le linee guida della vostra autorità cura degli animali e gli animali devono essere attentamente monitorati dopo l'intervento chirurgico. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Transezione dei risultati nervo ottico la perdita del 90% dei feriti RGCs entro 14 giorni postaxotomy 9-11. Il meccanismo principale di morte RGC è apoptosi 9, 12. La densità normale di RGCs è circa 2500 cellule / mm 2. Immagini epifluorescenza o confocale può essere utilizzato per visualizzare RGCs retrogrado etichettati dopo assotomia. Apoptosi RGC è ritardato di circa 4 giorni dopo assotomia, lasciando una finestra temporale per le manipolazioni sperimentali. Al 1 giorno dopo assotomia e marcatura retrograda con Fluorogold, corpi cellulari RGC nello strato di cellule gangliari della retina e fascicoli degli assoni nello strato delle fibre nervose della retina sono chiaramente visibili quando immagini una preparazione flatmounted (Fig. 1a). Con 14 giorni dopo assotomia, la maggior parte dei RGCs sono morti, e un RGCs pochi rimasti si alternano tra retina microglia (Fig. 1b). Quando RGCs apoptosi, microglia fagocitare le cellule morte e, quindi, sia transcellularly etichettati con il tracciante fluorescente che è stato usato per etichettare il RGCs 13, 14. L'aspetto del tracciante nel fagosomi della microglia è diverso da quello in RGCs sopravvivere. Microglia contenere il tracciante in fagosomi altamente concentrato e molto luminosi che sono relativamente grandi e sparse in tutta la loro citoplasma (Fig. 1c). RGCs hanno un modello più diffuso della colorazione (Fig. 1c) con piccole vescicole puntata retrogrado che sono stati trasportati i loro assoni deposito del citoplasma cellulare. Queste vescicole sono molto più piccole e hanno meno intensa fluorescenza permettendo di differenziare RGCs superstiti microglia. Inoltre, microglia hanno corpi cellulari molto più piccolo e tendono ad avere una morfologia stellata o ameboide in contrasto con RGCs che hanno corpi cellulari relativamente grande e arrotondata. Gli alberi dendritici di RGCs può anche aiutare a distinguerli dai processi breve brillante della microglia, nel quantificare la sopravvivenza delle cellule. Sopravvivenza delle cellule può essere quantificato in diverse regioni della retina e la densità (cellule / mm 2) può essere estrapolata dalla zona del micrografie corrispondente, dal momento che RGCs si trovano in un monostrato all'interno dello strato di cellule gangliari. <img src="/files/ftp_upload/2241/2241fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Micrografie epifluorescenza di Fluorogold RGCs etichettati dopo assotomia e l'applicazione del tracciante al moncone del nervo ottico. (A) 1 giorno dopo RGCs assotomia ed i loro fascicoli assone sono etichettati con il tracciante in un modo sottile puntata. (B) Entro il 14 assotomia giorni dopo, il 90% di RGCs sono morti e brillantemente etichettato microglia che hanno fagocitato le cellule morte sono etichettati con il tracciante. (C) superiore di ingrandimento che illustra la differenza tra RGCs e microglia (punte di freccia rossa) a 14 postaxotomy giorni. Barra di scala in A e B è di 50 micron. Barra di scala in C è di 25 micron.

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<li>Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+transcellular+staining+of+microglia+in+the+adult+rat+after+traumatic+degeneration+of+carbocyanine-filled+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Specific transcellular staining of microglia in the adult rat after traumatic degeneration of carbocyanine-filled retinal ganglion cells.</a> Exp Eye Res. 55, 101-117 (1992).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ci sono molte varianti di questa procedura chirurgica e parecchi dei passi in questo protocollo non sono necessari. E &#39;solo necessario ritirare i muscoli che si sovrappongono al nervo ottico al fine di ottenere l&#39;accesso al nervo. Tuttavia, questo si traduce in uno spazio molto limitato di lavoro intorno al nervo rendendo le fasi critiche finale di transezione più difficile. In certe situazioni è auspicabile trasfezione delle cellule dal tronco del nervo ottico e lo spazio maggiore accesso offerta dalla scompars...

<table><tbody><tr><td>Struttura stereotassica</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maschera per gas per ratto</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema di anestesia</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (&lt;sup&gt;Pr&lt;/sup&gt;AErrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>DIN 02225875</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio chirurgico</td><td>WPI, Zeiss, Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorogold -(idrossistilbammina bis(metansolfonato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39286</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Pharmacia Corporation (Pfizer)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tears Naturale P.M.</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proviodine</td><td>Medline Industries</td><td>MDS093945H</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla di Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette fini di Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Gancio microchirurgico</td><td>Fine Science Tools</td><td>10062-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette seghettate per medicazione oculare</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette seghettate curve e appuntite Dumont n. 7b</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di cauterizzazione</td><td>Fine Science Tools</td><td>18010-00</td><td></td></tr></tbody></table>

resezione del nervo ottico: un modello di apoptosi neuron adulti nel sistema nervoso centrale

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Cellule gangliari della retina (RGCs) sono i neuroni del SNC che in uscita le informazioni visive dalla retina al cervello attraverso il nervo ottico. Il nervo ottico si può accedere nell&#39;orbita dell&#39;occhio e completamente sezionato (axotomized), tagliando gli assoni di tutta la popolazione RGC. Resezione del nervo ottico è un modello riproducibile di apoptosi morte delle cellule neuronali del sistema nervoso centrale adulto 1-4. Questo modello è particolarmente interessante perché la camera vitreo dell&#39;occhio agisce come una capsula per la somministrazione di farmaci alla retina, permettendo manipolazioni sperimentali attraverso iniezioni intraoculari. La diffusione di sostanze chimiche attraverso il fluido vitreo assicura che agiscono su tutta la popolazione RGC. Inoltre, RGCs possono essere selettivamente trasfettate mediante l&#39;applicazione di breve RNA interferenti (siRNA), plasmidi o vettori virali per la fine taglio dei vettori nervo ottico 5-7 o iniettando nelle loro target, il collicolo superiore 8. Questo permette ai ricercatori di studiare i meccanismi apoptotici nella popolazione neuronale desiderato senza effetti confondenti sui neuroni spettatore o glia circostante. Un ulteriore vantaggio è la facilità e la precisione con cui sopravvivenza cellulare può essere quantificato dopo l&#39;infortunio. La retina è un piatto, tessuto stratificato e RGCs sono localizzate nello strato più interno, lo strato di cellule gangliari. La sopravvivenza di RGCs possono essere monitorati nel tempo mediante l&#39;applicazione di un tracciante fluorescente (3% Fluorogold) alla fine taglio del nervo ottico al momento della assotomia, o iniettando il tracciante nel collicolo superiore (target RGC) una settimana prima assotomia. Il tracciante è retrogrado trasportato, etichettatura l&#39;intera popolazione RGC. Poiché lo strato di cellule gangliari è un monostrato (una cella di spessore), densità RGC può essere quantificato in tessuto piatto montato, senza la necessità di stereologia. Resezione del nervo ottico conduce alla morte apoptotica del 90% dei feriti RGCs entro 14 giorni postaxotomy 9-11. RGC apoptosi è una caratteristica tempo-corso in cui viene ritardata la morte delle cellule postaxotomy 3-4 giorni, dopo di che le cellule degenerano rapidamente. Questo fornisce una finestra temporale per manipolazioni sperimentali diretti contro meccanismi coinvolti nella apoptosi.

Resezione del nervo ottico è un modello ampiamente utilizzato degli adulti lesioni del SNC. Il novanta per cento delle cellule gangliari della retina (RGCs) i cui assoni sono completamente recisi (assotomia) muoiono entro 14 giorni dopo assotomia. Questo modello è facilmente suscettibile di manipolazioni sperimentali e altamente riproducibile.

Resezione del nervo ottico: un modello di apoptosi Neuron adulti nel Sistema Nervoso Centrale

Le cellule gangliari della retina (RGC) sono neuroni del SNC che trasmettono le informazioni visive dalla retina al cervello, attraverso il nervo ottico.
Il nervo ottico può essere...

I neuroni delle cellule gangliari retiniche o RG Cs trasmettono l'informazione visiva dalla retina al cervello attraverso il nervo ottico Optic nerve. La sezione del nervo ottico rappresenta un modello riproducibile di morte cellulare neuronale apoptotica nel sistema nervoso centrale dell'adulto. In questo caso, la sezione del nervo ottico viene eseguita aprendo l'orbita superiore dell'occhio, permettendo l'accesso alle strutture sovrastanti il nervo ottico.La ghiandola lacrimale e i muscoli estrinseci dell'occhio vengono retratti e le guaine meningee del nervo ottico vengono aperte. Il nervo ottico viene quindi sollevato dalle guaine meningee e reciso. Alla fine, il 90% delle cellule gangliari retiniche lesionate, i cui assoni costituiscono il nervo ottico, muore per morte cellulare programmata entro due settimane dalla lesione.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri modelli di lesione cerebrale è che la sezione del nervo ottico è più riproducibile e i neuroni lesi possono essere bersagliati più facilmente mediante manipolazioni sperimentali. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle terapie per lesioni e malattie del sistema nervoso centrale, poiché la retina neurosensoriale fa parte del sistema nervoso centrale adulto. La dimostrazione di questa procedura sarà effettuata da Philippe Donofrio e Mark Magus per gli studenti laureati del mio laboratorio.Iniziare questa procedura posizionando un ratto nella camera di anestesia e impostando una concentrazione di isoflurano al 4%. Una volta che la respirazione dell'animale si è rallentata, commutare il flusso di gas sull'attacco della maschera facciale per il telaio stereotassico e posizionare l'animale nell'apparato stereotassico. Ridurre quindi la concentrazione di isoflurano al 2%. Applicare il cono nasale e monitorare l'anestesia. Inumidire il pelo sulla sommità della testa con etanolo al 70% per facilitare il taglio del pelo.Quindi, utilizzando delle forbici, rimuovere il pelo tra gli occhi con tamponi sterili di garza. Pulire l'area dell'incisione con tre applicazioni alternate di Betadine, seguite da etanolo al 70%. Successivamente, applicare un unguento oftalmico sulla cornea per evitarne l'essiccazione durante l'intervento chirurgico e distribuire l'unguento sulla superficie aprendo e chiudendo le palpebre.Utilizzando una lama numero 11, effettuare un'incisione lungo la linea mediana della testa da circa 0,5 centimetri davanti agli occhi fino a un centimetro dietro gli occhi. Con l'aiuto di una pinzetta, sollevare il lembo di pelle sopra l'occhio. Utilizzare il dorso del bisturi per staccare delicatamente il tessuto connettivo sottostante e liberare la pelle sovrastante.Quindi ritrarre lateralmente e inferiormente il lembo di pelle e mantenerlo in posizione con un retrattore chirurgico. Fissare il retrattore alla base dello strumento stereotassico e, tirando sulla fascia sovrastante con pinze a punta, effettuare un'incisione lungo il margine superiore dell'osso orbitario. Questo permetterà di allontanare la fascia sovrastante l'orbita dell'occhio.Utilizzare una pinzetta per premere sulla fascia sovrastante l'orbita e, con un piccolo strumento di cauterizzazione, delimitare chiaramente il margine dell'osso orbitario. L'uso dello strumento di cauterizzazione impedirà il sanguinamento dai vasi sottostanti che comunicano con i seni venosi. Utilizzare PBS freddo e sterile per pulire l'area chirurgica da qualsiasi traccia di sangue.L'area chirurgica deve essere pulita periodicamente in questo modo per permettere una migliore visualizzazione delle strutture nell'orbita dell'occhio. Una volta pulita l'incisione, utilizzare pinzette e il dorso del bisturi per rimuovere il tessuto connettivo situato nella parte posteriore dell'occhio, che ricopre i contenuti orbitali. Ciò permetterà di aprire la cavità orbitaria, fornendo una finestra chirurgica più ampia in cui operare.Successivamente, utilizzando pinze a curva affilate di Dumont numero sette B, rimuovere il tessuto connettivo che circonda la divisione oftalmica del nervo trigemino, situata vicino alla linea mediana, e rimuovere il nervo utilizzando le pinze. Sebbene questo passaggio non sia necessario, la rimozione del nervo fornirà una finestra di accesso più ampia al nervo ottico in un secondo momento, dopo la rimozione del nervo. Utilizzare le pinze per retrarre il vaso sanguigno sottostante e cauterizzarlo completamente.Questo passaggio non è necessario neanche in questo caso, tuttavia, la cauterizzazione del vaso consente di spostarlo in avanti, creando così una finestra più ampia. Una volta raggiunto il nervo ottico, utilizzare una pinzetta le cui punte siano state curve verso l'interno, per rimuovere con attenzione il sottile strato di tessuto connettivo presente sopra i muscoli estrinseci dell'occhio e sulla ghiandola lacrimale.Ritrarre i muscoli estrinseci dell'occhio dalla parte anteriore a quella posteriore dell'orbita. Afferrare la parte prossimale del muscolo con un paio di pinzette e utilizzare un secondo paio di pinzette curve, a denti, per medicazioni oculari, orientate nella stessa direzione del muscolo, per esercitare una trazione verso l'esterno. Rimuovere il muscolo più anteriore dell'orbita, il muscolo obliquo superiore.Di nuovo, utilizzando la stessa tecnica, rimuovere il retto mediale situato tra i lobi della ghiandola lacrimale e la ghiandola dura vicino alla linea mediana della superficie dorsale dell'occhio. Utilizzando pinzette, rimuovere delicatamente qualsiasi tessuto connettivo residuo sulla superficie della ghiandola lacrimale e sollevare la ghiandola verso l'alto. Non comprimere né schiacciare la ghiandola per ritrarla.Sollevare l'estremit&agrave; posteriore della ghiandola verso l'alto, quindi cauterizzare il vaso al polo posteriore. Successivamente, spostare in avanti la ghiandola lacrimale per aprire la parte posteriore dell'orbita, consentendo un accesso ininterrotto ai muscoli che sovrastano il nervo ottico. Applicare nuovamente PBS sterile per mantenere l'area umida e rimuovere il sangue con tamponi chirurgici utilizzando pinze fini.Rimuovere nuovamente il sottile tessuto connettivo che circonda i muscoli dell'orbita posteriore e separare i fasci muscolari sottostanti utilizzando la pinza curva a serratura per medicazioni oculari. Tirare lungo la direzione delle fibre muscolari per retrarre i muscoli in modo indipendente o simultaneo. Infine, fissare l'obiettivo muscolare residuo al retraettore insieme ai muscoli retratti e bloccare il retraettore con del nastro adesivo per applicare trazione.Questo farà ruotare l'occhio in avanti e all'esterno, in modo da esporre la guaina contenente il grasso che circonda il nervo ottico. Utilizzando una pinzetta Dumont a punta fine, sollevare delicatamente il tessuto connettivo che ricopre la guaina adiposa del nervo ottico, servendosi di forbici a molla per vene. Praticare un taglio longitudinale.Allarga il taglio secondo necessità. Il grasso contenuto nella guaina inizierà a fuoriuscire. Successivamente, solleva con attenzione dal bordo e recide le falde di tessuto a forma di mezzaluna utilizzando pinzette per tirare sul grasso.Tagliare il tessuto adiposo sovrastante il nervo ottico con le forbici a molla di Venezia. Con PBS sterile e tamponi chirurgici, rimuovere le piccole quantità di sangue che si formano durante l'asportazione del tessuto. Il nervo ottico è ora visibile e accessibile.La guaina meningea che circonda il nervo deve essere rimossa senza danneggiare l'arteria oftalmica, che irriga la retina interna. Utilizzando pinze per ruotare delicatamente il nervo, esaminare il modello vascolare della guaina meningea mediante pinze Dumont a punta fine. Afferrare la dura madre e tirare verso l'alto, creando una zona a forma di cuneo triangolare vicino alla base del nervo.Usare le forbici per praticare una piccola incisione longitudinale nella guaina meningea, avendo cura di non danneggiare la vascolarizzazione. Inserire la lama inferiore delle forbici nell'incisione e tagliare la guaina parallelamente alla direzione del nervo ottico.Utilizzare pinze e forbici per spostare lateralmente la dura rispetto al nervo ottico. L'unica copertura rimanente del nervo è la sottile e trasparente membrana aracnoidea. Per determinare se la membrana è ancora presente, utilizzare pinze appuntite per pizzicare la superficie del nervo e tirare verso l'esterno. Se le guaine meningee sono ancora presenti, saranno visibili.Se l'aracnoide è presente, pizzicare la membrana e tirare verso l'alto. Per creare una falda triangolare di tessuto, effettuare un piccolo taglio con la punta delle forbici. Quindi inserire la lama inferiore delle forbici ed eseguire un taglio longitudinale nell'aracnoide.Successivamente, utilizzare forbici e pinze per spostare l'aracnoide ai lati del nervo ottico. Con un uncino microchirurgico, sollevare il nervo ottico dalla guaina meningea. Passare la punta dell'uncino lungo il margine esterno del nervo, assicurandosi che l'uncino rimanga a contatto con il nervo.Evitare di afferrare le membrane meningee con il gancio e di tagliarle accidentalmente. Sollevare delicatamente il nervo ottico dalla guaina meningea e sezionare completamente il nervo dietro il punto sostenuto dal gancio. Il moncone del nervo ottico reciso avrà ora un'estremità libera.Rimuovere il gancio se le cellule gangliari della retina devono essere marcate in senso retrogrado. Per quantificare la sopravvivenza, posizionare un piccolo pezzo di gelatina spugnosa imbevuta di fluoro oro al 3% o di un altro tracciante retrogrado sul moncone del nervo ottico reciso. Alleviare la trazione sui muscoli estrinseci dell'occhio e premere sulla superficie oculare superiore in direzione della linea mediana per riportare l'occhio in posizione neutra.Nello stesso tempo, spingere il tampone di gelatina nell'orbita dell'occhio. Questo garantisce che l'occhio venga ruotato nuovamente nella sua posizione e che il gelfoam rimanga intorno al moncone del nervo ottico. Riposizionare la ghiandola lacrimale e i muscoli estrinseci dell'occhio nella loro sede naturale e riportare il lembo di pelle alla linea mediana, quindi suturare la ferita.Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi. Al termine dell'intervento chirurgico, spegnere l'isoflurano e lasciare che l'animale respiri ossigeno per alcuni minuti. Rimuovere l'animale dal dispositivo stereotassico.Posizionare l'animale in una gabbia sotto una lampada a infrarossi per il recupero, al fine di eliminare il rischio che il ratto aspiri la lettiera durante la fase di ripresa. Assicurarsi che non ci sia lettiera nella gabbia di recupero. Somministrare analgesici post-chirurgici.In base alle linee guida istituzionali, monitorare attentamente l'animale dopo l'intervento chirurgico. La sezione del nervo ottico provoca la perdita del 90% dei RGC lesi entro 14 giorni dalla sezione. Il meccanismo principale della morte dei RGC è l'apoptosi.La densità normale delle cellule gangliari retiniche è di circa 2.500 cellule per millimetro quadrato. L'imaging epifluorescente o confocale può essere utilizzato per visualizzare le cellule gangliari retiniche marcate retrogradamente. Dopo la sezione del nervo ottico.L'apoptosi delle RGC è ritardata di circa quattro giorni dopo la sezione del nervo ottico, lasciando una finestra temporale per manipolazioni sperimentali al primo giorno successivo alla sezione del nervo ottico e alla marcatura retrograda con Flora Gold. I corpi cellulari delle RGC nello strato gangliare della retina e i loro assoni nello strato delle fibre nervose della retina sono chiaramente visibili. Durante l'analisi di preparati in montaggio piatto a 14 giorni dopo la sezione del nervo ottico, la maggior parte delle RGC è morta e poche RGC residue sono disseminate tra le microglia retiniche. Quando le RGC vanno incontro ad apoptosi, le microglia fagocitano le cellule morte e, di conseguenza, vengono marcate cellularmente con un tracciante fluorescente precedentemente utilizzato per etichettare le RGC, come indicato dalle frecce rosse.L'apparenza del tracciante nei fagociti delle microglia è diversa rispetto a quella nei rgc sopravvissuti. Le microglia contengono il tracciante in fagociti altamente concentrati, estremamente luminosi, relativamente grandi e distribuiti in tutto il loro citoplasma. I rgc mostrano un modello di colorazione più diffuso, con piccole vescicole puntiformi che sono state trasportate retrogradamente lungo i loro assoni, riempiendo il citoplasma cellulare.Queste vescicole indicate dalle frecce bianche sono molto più piccole e presentano una fluorescenza meno intensa, permettendo di distinguere i RGC sopravvissuti dai microglia. Inoltre, i microglia hanno corpi cellulari molto più piccoli e tendono ad avere una morfologia a placca ST o AME, contrariamente ai RGC che possiedono corpi cellulari relativamente grandi e rotondeggianti. Una volta applicata la mascheratura, questa tecnica può essere completata con successo in 15 minuti se eseguita correttamente; durante l'esecuzione di questa procedura, è importante evitare danni all'apporto sanguigno retinico poiché la retina degenererà se la vascolarizzazione viene compromessa a seguito di questa procedura.Altri metodi, come iniezioni intravitreali o iniezioni nel moncone del nervo ottico reciso, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio: Quali sono i meccanismi coinvolti nell'apoptosi delle cellule gangliari retiniche.

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