Name: Imaging in vivo di intatto Larve di Drosophila a livello sub-cellulare Risoluzione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 51 s
Description: Impara a eseguire imaging in vivo di larve di Drosophila melanogaster con anestesia al desflurano. Questo metodo consente imaging sub-cellulare ad alta risoluzione delle giunzioni neuromuscolari con sopravvivenza del 95%.

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Ringraziamo Andreas Schönle, Max-Plank-Institut di chimica biofisica, Germania e David J. Sandstrom, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA per un parere tecnico. Ringraziamo Frank Kötting, European Neuroscience Institute di Gottinga per la costruzione della camera di imaging e il dispositivo di anestesia. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal Forschung Alzheimer Iniziativa per TMRYZ è stato sostenuto da una borsa di studio della borsa di studio in Cina Consiglio, SBH da una borsa di studio della Graduate School per Cellulare e Molecolare Neuroscienze, Università di Tubinga.

A) Assemblea della camera di imaging <ol><li> Seleziona una larva di fase scelto (ad esempio, all'inizio del 3 ° larve instar lasciando un intervallo di osservazione di circa 24 ore a 25 ° C fino errante stadio). </li><li> Sciacquare la larva con acqua per pulire il terreno di coltura e tamponare asciugare. </li><li> Rivestire il centro dell'elemento fondo della camera, la regione ad affrontare la larva, con un sottile strato di olio alocarburi. </li><li> Mettere la larva con il lato ventrale rivolto verso l'obiettivo microscopio nella camera (consente di giunzione neuromuscolare (NMJ) 26 e 27 per essere ripreso) (Figura 1 AE). </li><li> Posizionare il distanziatore in plastica sullo strato di petrolio, con la prese d'aria del viso verso l'alto della griglia (Figura 1 A). Si prega di verificare a questo punto: L'altezza del distanziatore è circa la metà del diametro larvale, la larghezza della fessura dovrebbe essere circa il doppio del diametro della larva. </li><li> Posizionare la camera di immagini al microscopio </li></ol> B) anestesia della larva <ol start="7"><li> Collegare i due ingressi della camera con un appropriato dispositivo di anestesia / vaporizzatore. Si prega di verificare up-front: La concentrazione efficace di desflurane nella camera d'aria non deve mai superare quella indicata dalle norme di sicurezza! Solo un piccolissimo volume totale di desflurane è necessaria per anestetizzare le larve. L'applicazione del 15% (v / v) di desflurano 1 ha dimostrato di essere un buon punto di partenza per determinare la concentrazione ideale per essere usato in un esperimento. Per motivi di sicurezza si consiglia che il vaporizzatore non dovrebbe contenere più del necessario desflurano per 2-4 ore di imaging in vivo. </li><li> Immergere l'altra estremità del tubo collegato alla uscita della camera in un bicchiere d'acqua e poi aprire le valvole che controllano il flusso dei anestetico nella camera per circa cinque secondi. Si prega di verificare in questa fase: Fare le bolle d'aria salire in acqua? Se la camera non è che perde. </li><li> Chiudere le valvole per circa tre secondi. </li><li> Monitorare i movimenti residui larvale al microscopio. Verificare sia il battito cardiaco e movimenti muscolari. Se necessario le valvole aprono e si chiudono come descritto al punto 8 e 9 fino anestesia della larva è completa, quindi chiudere tutte le valvole e iniziare imaging. Si prega di verificare in questa fase: Movimento muscolare residua o di battito cardiaco indica che la larva non viene adeguatamente anestetizzato. Anestesia completa è di vitale importanza per le immagini ad alta risoluzione. La larva normalmente non dovrebbero essere anestetizzati per più di 15-20 minuti in un dato momento. </li></ol> C) Imaging <ol start="11"><li> Identificare la corretta posizione e l'immagine della struttura di interesse (Figura 2-4). </li></ol> D) Il recupero da anestesia <ol start="12"><li> Dopo l'imaging è completato entrare aria nella camera. Si prega di verificare in questa fase: Controllare il battito cardiaco e contrazioni muscolari della larva di luce alogena trasmessa. Come i muscoli comincerà a contrarsi, è possibile rimuovere la larva dalla camera di imaging. </li><li> Staccare la camera dal dispositivo di anestesia e rimuoverlo dal microscopio. Smontare la camera con attenzione e posto la larva nel medio purè di coltivazione volare. </li><li> Conservare il piatto in un incubatore alla temperatura appropriata. </li></ol> E) Tempo di serie <ol start="15"><li> Ripetere i passaggi 2-14 punti fino a un tempo sufficiente sono stati ottenuti. Alternative protocollo: Se la larva è quello di essere ripreso più di una volta all'interno di un intervallo di 30 minuti potrebbe essere pratico di lasciarlo nella camera di imaging fino al punto successivo momento anestesia. Ripetere i passaggi 7-14 punti fino a un tempo sufficiente sono stati ottenuti. Si prega di verificare in questa fase: La larva non deve essere conservato nella camera di imaging per più di due ore alla volta, né è di essere anestetizzati per più di 15-20 minuti alla volta. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Assemblea della camera di imaging. (A) Posizionare la larva e il distanziatore in plastica sullo strato di olio. (B) Mettere un 22 x 22 mm sul vetrino il distanziale e inserire l'anello di guida in plexiglas nella camera accanto (C) fissare la posizione della larva con l'anello in metallo e (D) nei pressi della camera. (E) Ora la camera è pronto per essere montato sul microscopio. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 Body-muro muscoli larve di Drosophila. Muscoli e NMJs sono stati visualizzati mediante espressione di un CD8-GFP-Sh proteina di fusione 8. I muscoli sono mostrati come osservato quando concentrandosi sul lato ventrale attraverso la cuticola nella larva. In (CA) il muscolo più superficiale, 27 anni, è dimostrato, in (KL), i muscoli più interna, 6 e 7, sono mostrati. Scala Bar: 100 micron, ΔZ tra le sezioni è di 2 micron. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 Identità del corpo parete muscoli larve di Drosophila. L'identità dei muscoli larve L3 Drosophila, A3 segmento, viene visualizzato. Muscoli e NMJs sono stati visualizzati mediante espressione di un CD8-GFP-Sh proteina di fusione 8. I muscoli vengono visualizzati come osservato quando concentrandosi sul lato ventrale attraverso la cuticola in larve. In AC il muscolo più superficiale, 27 anni, è dimostrato, nel KL i muscoli più interno, 6 e 7, sono mostrati. Scala Bar: 100 micron, ΔZ tra le sezioni è di 2 micron. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 Identità di giunzioni neuromuscolari di larve di Drosophila. (AD) NMJs sono state visualizzate da espressione di un DGluRIIA-MRFP proteina di fusione 1. Il NMJs sono mostrate come osservato quando concentrandosi sul lato ventrale attraverso la cuticola in larva. In (AB) il più superficiale NMJ, 27 anni, è dimostrato, CD NMJs più interno, 6 e 7, sono mostrati. Scala Bar: 100 micron, ΔZ tra le sezioni è di 5 micron. (E) e (F) l'identità del superficiale (E) e più interni (F) NMJs è dato per riferimento.

<ol><li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+dynamics+organizing+synapse+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo.</a> Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).</li>
<li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22In+vivo+imaging+of+long-term+changes+in+the+Drosophila+neuromuscular+system+%5B%5D%22">In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]</a>. , Georg-August-University Göttingen. (1988).</li>
<li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li>
<li>Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+axonal+transport+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging axonal transport of mitochondria.</a> Methods in enzymology. 457, 319-333 (2009).</li>
<li>Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+fluorescence+tomography+for+in-vivo+imaging+of+developing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Lin, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Drosophila+larva+by+multiphoton+autofluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy.</a> Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).</li>
<li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &amp, Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo proposto è stato inizialmente sviluppato per studiare le sinapsi glutammatergica sui muscoli della parete del corpo delle larve di Drosophila melanogaster. La Drosophila giunzione neuromuscolare (NMJ) è caratterizzato da una stereotipata cito-architettura dei muscoli e neuroni ed è quindi ideale per l&#39;imaging in vivo. Tuttavia, il protocollo di anestesia descritto non è limitata alle immagini del NMJ, la trasparenza delle larve di Drosophila facilita l&#39;adattamento del protocollo descritto per studiare lo sviluppo degli organi, la migrazione delle cellule, il trasporto di merci assonale e sub-cellulare riorganizzazione all&#39;interno delle cellule.

Reagenti: <ul><li> Desflurano (Suprane, Baxter, Unterschleißheim, Germania) </li><li> Halocarbon olio (ad esempio Voltalef H10S olio / Atofina, Puteaux, Francia) </li><li> Vola terreno di coltura </li></ul> Attrezzatura: <ul><li> Invertito microscopio confocale </li><li> Microscopio binoculare (ad esempio Stemi 2000, Carl Zeiss, Jena, Germania) </li><li> Pennello piccolo utilizzato per ordinare le mosche </li><li> Incubatrice </li><li> Costruito su misura da camera per immagini (Per i disegni meccanici vedere rif. 3) </li><li> Vaporizzatore / anestesia periferica (Per i dettagli vedi rif. 3) </li></ul>

imaging in vivo di intatto larve di drosophila a livello sub-cellulare risoluzione

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recenti miglioramenti nel campo dell&#39;imaging ottico, fluorofori geneticamente codificato e strumenti genetici permettono stabilimento efficiente delle desiderato linee di animali transgenici hanno permesso i processi biologici da studiare nel contesto di una vita, e in alcuni casi anche comportarsi, organismo. In questo protocollo verrà descritto come anestetizzare intatte le larve di Drosophila, utilizzando il anestetico volatile desflurano, per seguire lo sviluppo e la plasticità sinaptica delle popolazioni a una risoluzione 1-3 sub-cellulare. Mentre gli altri metodi utili per anestetizzare le larve di Drosophila melanogaster sono stati precedentemente descritti 4,5,6,7,8, il protocollo presentato nel presente documento dimostra miglioramenti significativi per le seguenti caratteristiche combinate principali: (1) Un elevato grado di anestesia, anche il battito cardiaco viene arrestato consentendo risoluzione laterale fino a 150 nm 1, (2) un elevato tasso di sopravvivenza del&gt; 90% per ciclo di anestesia, che consentono la registrazione di oltre cinque punti-tempo in un periodo di ore o giorni 2 e ( 3) una sensibilità elevata che ci permette in 2 casi per studiare la dinamica delle proteine ​​espresse a livelli fisiologici. Nel dettaglio, siamo stati in grado di visualizzare i post-sinaptica subunità del recettore del glutammato GluR-IIA espresso tramite il promotore endogeno 1 in stabile linee transgeniche e la linea trappola FasII esone-GFP 1. (4) A differenza di altri metodi di 4,7 le larve possono essere esposte non solo vivo, ma anche interi (cioè non sezionato) che consente l&#39;osservazione che si verifichi un certo numero di giorni 1. I dettagli del video che accompagna la funzione delle singole parti della camera di imaging in vivo 2,3, il corretto montaggio delle larve, la procedura di anestesia, come ri-identificare le posizioni specifiche all&#39;interno di una larva e la rimozione sicura delle larve dalle immagini da camera.

Questo protocollo descrive un metodo affidabile per l&#39;anestesia e l&#39;imaging di intatta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larve. Abbiamo utilizzato il anestetico volatile desflurano per consentire immagini ripetitive a livello sub-cellulare risoluzione e re-identificazione di strutture fino a pochi giorni<sup&gt; 1</sup&gt;.

Imaging in vivo di intatto Larve di Drosophila a livello sub-cellulare Risoluzione

I recenti progressi nell'imaging ottico, nei fluorofori codificati geneticamente e negli strumenti genetici che consentono la creazione efficiente di animali transgenici desiderati...

I progressi nell'imaging ottico e nei sensori genetamente codificati per la forza hanno permesso agli scienziati di studiare i processi biologici di loro interesse negli organismi viventi e, in alcuni casi, persino negli organismi in attività. Mentre grande enfasi è stata posta sullo studio del cervello dei mammiferi in vivo, il nostro laboratorio utilizza un sistema modello piuttosto semplice, la giunzione neuromuscolare trofica, e nel video seguente spiegheremo come anestetizzare e osservare larve di moscerino della frutta al fine di seguire lo sviluppo di sinapsi individuali nel tempo, per un periodo che va da alcune ore fino a giorni, come metodo per studiare lo sviluppo della funzione. Esistono metodi alternativi, ma il protocollo qui presentato si distingue per le seguenti caratteristiche principali.Prima di tutto, grazie a un grado molto elevato di anestesia, anche il battito cardiaco viene arrestato, condizione essenziale per ottenere un'elevata qualità dell'immagine. In secondo luogo, grazie a un tasso di sopravvivenza del 95% e alla capacità di acquisire immagini estremamente sensibili. Il seguente protocollo ci permette, ad esempio, di studiare la dinamica dei recettori del glutammato marcati con GFP ed espressi a livelli fisiologici mediante i loro promotori endogeni.Imparerai ora come inserire le larve nella camera di imaging, come anestetizzare il frutto per le larve, come individuare una posizione specifica all'interno delle larve per visualizzare la struttura a scala, e quindi anche come recuperare le larve dopo l'analisi. Prima dell'imaging in vivo, è importante lavare le larve. Sebbene questo processo sia semplice, è necessario fare attenzione a non danneggiarle e pertanto non si devono mai usare pinzette per spostarle.Invece, optiamo per movimenti delicati con un pennello. L'acqua utilizzata per il lavaggio è a temperatura ambiente ed è semplice acqua di rubinetto, non distillata e priva di detergenti. Possiamo vedere ya.Si spostano delicatamente le larve dal cibo all'acqua corrente fresca per ottenere buoni risultati. È inoltre fondamentale mantenere le larve in acqua per il minor tempo possibile. Questo impedirà all'acqua di entrare nelle trachee, il che ostacola la respirazione e anche il processo di anestetizzazione.Successivamente, prepariamo la camera per l'acquisizione delle immagini. Innanzitutto, stendiamo uno strato molto sottile di olio sul fondo della camera. Poi posizioniamo i larve sopra questo film di olio.È importante prestare attenzione affinché le estremità dei re non tocchino l'olio. Una volta posizionati, collochiamo una griglia distanziatrice sopra i larvi. È fondamentale che i tre canali siano rivolti verso l'alto, in modo da permettere l'afflusso di aria ai larvi e da evitare che si otturino con l'olio.Ora posizioniamo un coprioggetto sulla parte superiore dello spaziatore e verifichiamo che la larva sia correttamente posizionata, in modo che il lato ventrale sia rivolto verso il basso e il lato dorsale, terminale delle trachee, dove possiamo vedere le trachee, sia rivolto verso l'alto. Ora posizioniamo anche un anello adattativo in plastica e un anello metallico per assicurare che la larva sia premuta uniformemente tra i due vetrini sovrastanti.Ora chiudiamo la camera di imaging e la spostiamo sul microscopio confocale per iniziare l'acquisizione delle immagini. Ora si posiziona la camera di imaging con le larve montate sulla parte superiore del nostro microscopio confocale.Emergono tre tubi dalla camera di imaging. Uno è collegato all'agente anestetizzante difluorina. Un altro è un tubo di uscita e l'ultimo tubo permette all'aria fresca di raggiungere le larve.Dopo aver collegato la camera delle larve al dispositivo di anestesia, è importante verificare che la larva sia posizionata correttamente. Yao quindi permette all'aria di entrare nel sistema di anestesia tramite la pompa. In questo momento, è fondamentale assicurarsi che la pressione all'interno della camera non superi il valore massimo raccomandato.Quindi inserisce il tubo di uscita nell'acqua per assicurarsi che ci sia flusso d'aria. Le bolle nella bottiglia d'acqua dimostrano il passaggio dell'aria. Apre ora lentamente la valvola e permette al difluoro di fluire brevemente attraverso i tubi.Dopo l'anestetizzazione iniziale, è importante verificare come reagisce la larva. Se il cuore sta ancora battendo, è necessario applicare ulteriore anestetizzazione, come si può osservare. Nella prossima sezione, vi mostreremo la larva al microscopio.Ora possiamo osservare la parte critica del processo di anestetizzazione attraverso il microscopio. Inizialmente, si possono vedere i movimenti delle larve con i muscoli che continuano a contrarsi. Una volta che i movimenti cominciano a rallentare, si eseguono scansioni su e giù lungo le larve e si osserva l'anestetizzazione in atto.I movimenti rallentano e alla fine si fermano. Dopo l'applicazione di più impulsi di anestetizzazione, possiamo osservare che la larva ha smesso di muoversi e l'unico movimento visibile è dovuto a modifiche apportate al microscopio. Per determinare il grado di anestetizzazione, è importante verificare il battito cardiaco.He yao si concentra in profondità nella lava dove è principalmente visibile il corpo grasso. È importante notare che è possibile osservare la regione circostante il cuore ed è evidente che il battito cardiaco si è arrestato, quindi la larva è pronta per l'acquisizione delle immagini. Una delle principali difficoltà nell'acquisizione di immagini in vivo è l'identificazione della giunzione neuromuscolare di interesse.Per aiutarvi in questo, mostreremo come appare durante la scansione delle larve. A questo punto potrete vedere una giunzione neuromuscolare che utilizziamo generalmente per l'acquisizione di immagini. Ora iniziamo a mettere lentamente a fuoco all'interno delle larve.Partendo dalla superficie della cuticola, si osserveranno alcuni muscoli che appaiono e scompaiono. Alcuni di questi sono evidenziati. Il filmato mostra un costrutto di fusione artificiale contenente il dominio transmembrana CD8, GFP e la regione C-terminale della proteina del canale del ferro Shaker.Questo costrutto si localizza su tutte le membrane muscolari e mostra una presenza aumentata alla giunzione neuromuscolare. Ora riprodurremo il filmato a velocità ridotta e, con l'aiuto delle figure due e tre, potrete identificare i singoli muscoli man mano che appaiono e scompaiono. Sebbene questi moscerini siano particolarmente utili per imparare l'imaging in vivo, in genere utilizziamo larve che esprimono marcatori, etichettando esclusivamente le regioni post-sinaptiche o pre-sinaptiche della sinapsi.Poiché queste non delimitano l'intera superficie muscolare, è molto più difficile identificare la stessa posizione nelle larve. In questo filmato, mostriamo recettori del glutammato marcati con RFP. Il filmato ci mostra mentre mettiamo a fuoco all'interno dell'etichetta e abbiamo evidenziato singole giunzioni neuromuscolari.Riprodurremo nuovamente il filmato a velocità ridotta e potrete identificare le singole giunzioni neuromuscolari utilizzando la figura quattro come riferimento. Ora abbiamo affrontato la teoria. Illustreremo un esempio pratico.Ora ci concentreremo sulla giunzione neuromuscolare 27 nelle larve che esprimono GFP shaker in MHC CD otto. Dopo aver aumentato l'ingrandimento digitale, riposizioniamo la giunzione neuromuscolare e quindi ci spostiamo nella direzione C verso la regione centrale per assicurarci che la larva sia correttamente posizionata e che non vi siano pixel sovrasaturi o sottosaturi. È possibile osservare i pixel sovrasaturi in rosso, mentre i pixel sottosaturi sono visualizzati in blu.Riduciamo la potenza del laser e eseguiamo nuovamente la scansione. Ora abbiamo un guadagno e una potenza laser adeguati e quindi non presentiamo più alcuna regione sovrasatura. Ora è importante segnare la posizione della giunzione neuromuscolare nella direzione C.Prima di tutto, segniamo la posizione inferiore di scansione e successivamente quella superiore per consentire la registrazione accurata dell'intero stack CST. In genere utilizziamo una dimensione del pixel di 100 nanometri per 100 nanometri e la distanza lungo l'asse C è di 500 nanometri. Se non prevediamo di eseguire la deconvoluzione dopo l'acquisizione per elaborare le nostre immagini, i guadagni vengono impostati a un livello appropriato per evitare rumore, ma consentendo al contempo l'uso di una potenza laser ridotta per minimizzare lo sbiancamento una volta completato lo stack CST.La giunzione neuromuscolare che esprime il costrutto GFP M-H-C-C-D-H shaker viene registrata correttamente. Nella sezione seguente, completiamo un processo simile concentrandoci sui recettori del glutammato. Per registrare i recettori del glutammato marcati con RFP, ci concentriamo nuovamente attraverso il tegumento e osserviamo ora le singole giunzioni neuromuscolari nel segmento A3.Dopo aver ingrandito la giunzione neuromuscolare destra, la riposizioniamo al centro del campo visivo. Come fatto in precedenza, dobbiamo assicurarci di non avere pixel sovraesposti o non saturi. Ancora una volta, risulta evidente che alcuni pixel sono sovrasaturi, quindi regoliamo le impostazioni ed eseguiamo un'altra scansione di prova.I guadagni nella potenza del laser sono ora regolati correttamente. Ora è importante impostare i limiti dello stack CST identificando prima la posizione superiore e verificandola, quindi la posizione inferiore. Ora possiamo iniziare a scansionare i singoli piani della giunzione neuromuscolare.È importante acquisire alcune scansioni di controllo di sezioni immediatamente al di sotto e al di sopra della giunzione neuromuscolare per evitare di perdere sinapsi posizionate in queste aree. Una volta completata la scansione al microscopio confocale, proietteremo la giunzione neuromuscolare per osservare un risultato tipico ottenuto mediante imaging in vivo. È fondamentale conservare questa immagine per confrontarla con scansioni effettuate in successivi punti temporali, in modo da poter riesaminare la giunzione neuromuscolare e identificare eventuali modifiche, come nuove sinapsi o battoni sinaptici.Dopo aver completato con successo l'imaging, è importante svegliare rapidamente la lava e rimuoverla in fretta dalla camera di imaging. Yao sta eseguendo questa operazione monitorando continuamente la lava e regolando il dispositivo di anestetizzazione in modo che nell'apparecchio circoli aria fresca invece di solo fluoro.Ora posiziona l'uscita della camera nell'acqua e le bolle d'aria mostrano che l'aria sta fluendo attraverso il sistema. Continua a monitorare costantemente le larve per assicurarsi che il battito cardiaco riprenda e che la larva si risvegli. Analogamente al processo di anestetizzazione, è preferibile fornire alle larve più impulsi d'aria per garantire un risveglio efficace.Ora possiamo osservare cosa fa ya attraverso il microscopio. Possiamo vedere mentre applica aria al sistema. Nel compartimento si generano variazioni di pressione, che inducono movimenti artificiali nelle larve.Infine, la larva inizia a muoversi autonomamente e questo fenomeno è meglio osservabile all'inizio dei movimenti cardiaci; pertanto, mettiamo a fuoco la larva in modo da poter vedere questi movimenti con maggiore chiarezza. I battiti ritmici visibili indicano un risveglio avvenuto con successo. Dopo aver risvegliato con successo la larva, è importante recuperarla dalla camera di imaging.Il larva si trova nella sezione inferiore della camera, quindi il coperchio superiore viene messo da parte. Yara rimuove il peso in metallo e il coperchio in plastica. Successivamente, viene rimosso il vetrino coprioggetti e poi lo spaziatore in plastica con le larve.Rimuove con cura le larve dal distanziatore di plastica utilizzando il pennello. Successivamente le immerge brevemente in acqua e le asciuga per eliminare l'olio in eccesso. La larva viene ora posta in del cibo precedentemente sminuzzato e lasciata lì fino al momento del riutilizzo.

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