Metodi per manipolazioni sperimentali dopo resezione del nervo ottico nel sistema nervoso centrale dei mammiferi

I neuroni delle cellule gangliari retiniche, o RGc, sono cellule nervose del sistema nervoso centrale che trasmettono le informazioni visive dalla retina al cervello attraverso il nervo ottico. Nel video correlato, è stato illustrato un metodo per assonotomizzare, o recidere, gli assoni dell'intera popolazione di cellule gangliari retiniche come modello di morte cellulare neuronale apoptotica nel sistema nervoso centrale adulto. Qui, questo metodo viene abbinato a procedure che mirano direttamente fattori neurotrofici, RNA interferenti corti, plasmidi o vettori virali che codificano proteine anti-ATO verso le cellule gangliari retiniche lesionate o verso la retina, al fine di bersagliare la retina in modo globale.

Viene assemblato un apparato per iniezioni intracheo e utilizzato per iniettare sostanze nella camera vitrea dell'occhio, al fine di colpire in modo specifico le cellule gangliari retiniche. Si può posizionare Gelfoam oppure utilizzare siringhe Hamilton per iniettare sostanze nel nervo ottico. I risultati dell'imaging degli assoni indicano che la sopravvivenza delle cellule gangliari retiniche può essere aumentata mediante il rilascio di fattori anti-apoptotici.

Utilizzando queste tecniche, questo metodo può essere impiegato per identificare le proteine coinvolte nell'apoptosi neuronale adulta nel sistema nervoso centrale. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi di malattie del sistema nervoso centrale, poiché la sezione del nervo ottico rappresenta un modello riproducibile per l'apoptosi neuronale nel SNC adulto. In generale, coloro che sono alle prime armi con questa tecnica incontrano difficoltà perché danneggiano il cristallino durante l'inserimento della pipetta di vetro nella camera vitrea dell'occhio. Per preparare il sistema della siringa per iniezioni intraoculari, iniziare rimuovendo qualsiasi ago o dado RN.

Presente in una siringa Hamilton da 10 microlitri a tenuta stagna per gas, modello 1701. Inserire il feral in PFA nel feral della coppa del raccordo a compressione. Successivamente, inserire l'intero raccordo nell'estremità della siringa e avvitare leggermente il dado RN sulla parte superiore.

Inserire un'estremità di un tubo capillare da un sedicesimo di pollice nel raccordo a compressione, facendolo passare attraverso l'apertura nel dado RN. Assicurarsi che il tubo capillare sia completamente inserito. Stringere il dado RN per comprimere la guarnizione, in modo da sigillare il tubo capillare.

Ripetere questo processo su entrambe le estremità del biconnettore in vetro RN. Fissare l'estremità libera del tubo di raccordo a un'estremità del biconnettore in vetro RN serrando il dado RN. La micropipetta in vetro formerà l'ago e il corpo del sistema di iniezione.

Inserire la pipetta di vetro nell'estremità libera del connettore in vetro RN doppio. Stringere il dado RN per fissare la pipetta in posizione. Sotto un microscopio stereoscopico, creare una punta con il diametro appropriato tenendo una micropipetta tirata con un angolo e sfregando la punta lungo la superficie smerigliata di un vetrino per creare una rottura.

Il terminale finale dovrebbe essere leggermente smussato. Successivamente, utilizzare un kit di preparazione della siringa della Hamilton Syringe Company riempito con siringa, collegamento per tubo capillare, giunzione in vetro RN doppia e la micropipetta in vetro con olio minerale per l'uso. Con il sistema di iniezione idraulico, sostituire l'ago con un ago Hamilton 9 0 0 3 0.

Successivamente, posizionare un setto di gomma sull'ago Hamilton 9 0 0 3 0 per creare una chiusura ermetica durante l'iniezione dell'olio minerale. Inserire l'ago Hamilton 9 0 0 3 0 della siringa di spurgo nella parte posteriore del cilindro della siringa Hamilton da 10 microlitri del sistema di iniezione. Premere saldamente il setto contro l'estremità della siringa per creare una chiusura ermetica.

Premere lentamente lo stantuffo: l'olio minerale passerà attraverso gli elementi in vetro del sistema di iniezione, riempiendo la pipetta di vetro. Spingere tutto l'olio attraverso il sistema di iniezione per rimuovere eventuali bolle d'aria lungo il percorso.

Se la siringa di riempimento sta esaurendo l'olio minerale, ritirare lentamente l'ago mentre si continua a erogare olio costantemente. Per evitare la formazione di bolle d'aria, ricaricare la siringa di spurgo e iniettare nuovamente. Quando l'intero sistema sarà riempito con olio minerale, inserire lo stantuffo originale della siringa da 10 microlitri.

Con una siringa Hamilton, premere completamente lo stantuffo per rimuovere ulteriore olio minerale dal sistema. Pulire accuratamente la micropipetta di vetro e l'estremità della siringa. Con il 70% di etanolo, arretrare lo stantuffo fino al segno dei due microlitri presente sul cilindro.

L'estremità della micropipetta di vetro si riempirà d'aria, creando una zona tampone tra l'olio minerale e il liquido da iniettare. Riempire il corpo della pipetta immergendo l'estremità della micropipetta nella soluzione desiderata ed estraendo lo stantuffo della siringa Hamilton. Per effettuare l'iniezione intraoculare, non più di quattro-cinque microlitri di soluzione verranno iniettati nell'occhio di un ratto adulto.

Iniziare passando il flusso di gas all'attacco della maschera per anestesia del telaio stereotassico. Quindi posizionare un ratto anestetizzato con isoflurano nell'apparato stereotassico. Ridurre la concentrazione di isoflurano al 2% e monitorare l'anestesia.

Coprire l'animale con una coperta chirurgica. Per mantenere la temperatura corporea durante l'intervento, aprire le palpebre e applicare una goccia di soluzione anestetica oculare. L'iniezione sulla superficie della cornea richiede due persone: una per inserire la pipetta di vetro nella camera vitrea e mantenerla in posizione.

E un altro per premere lo stantuffo della siringa, che rilascia la soluzione desiderata. Sotto un microscopio chirurgico, afferrare la micropipetta di vetro e il connettore in vetro RN doppio, allargare le palpebre formando una V opposta al sito di iniezione. Con le dita, l'occhio si solleverà dall'orbita. Inserire delicatamente la punta della micropipetta di vetro in un'area priva di vasi sanguigni e attraverso la sclera con un angolo verso il basso.

Quando la pipetta penetra nella sclera, si avvertirà un lieve scatto. La persona che tiene la siringa deve ora iniettare quattro microlitri di soluzione premendo lo stantuffo fino al segno dei due microlitri sulla siringa. L'iniezione dovrebbe richiedere circa uno o due secondi.

La soluzione iniettata con successo fluirà attraverso la camera vitrea, mantenere la micropipetta ferma per circa cinque secondi, quindi ritirarla nella stessa direzione in cui è stato inserito l'ago; la congiuntiva si richiuderà sull'apertura, contribuendo a sigillare la puntura sclerale. Al termine dell'intervento, spegnere l'isoflurano e lasciare che l'animale respiri ossigeno per alcuni minuti. Coprire la superficie della cornea con un unguento oftalmico per prevenire l'essiccazione corneale durante il recupero, quindi rimuovere l'animale dal dispositivo stereotassico e riposizionarlo nella gabbia di recupero.

Per manipolare le cellule gangliari della retina mediante trasporto retrogrado dopo esotomia. Eseguire innanzitutto una transezione del nervo ottico seguendo le istruzioni riportate nel protocollo abbinato del video "transezione del nervo ottico", 2, 2 4, 1 traccianti farmaci. Plasmidi, siRNA o vettori virali possono essere applicati al moncone del nervo ottico.

Esistono due metodi principali per eseguire questa procedura: l'uso di schiuma gelatinosa o l'iniezione diretta nel nervo ottico. Se si utilizza il metodo della schiuma gelatinosa, assicurarsi che le cellule gangliari retiniche siano state precedentemente marcate mediante iniezione di traccianti retrogradi nel collicolo superiore una settimana prima della tassonomia. Immediatamente dopo il taglio del nervo ottico, posizionare un piccolo pezzo di schiuma gelatinosa imbevuto della soluzione sperimentale sull'estremità recisa del nervo ottico, quindi riportare i contenuti orbitali alla loro posizione originaria.

Quando l'occhio viene riportato in posizione neutra, utilizzare una pinzetta per spingere il pezzo di gelatina spugnosa all'interno dell'orbita, assicurandosi che rimanga sopra l'estremità del nervo ottico. La tecnica di iniezione è più efficace per il rilascio di sostanze che devono accedere al citoplasma dell'assone per essere trasportate retrogradamente mediante flusso citoplasmatico. Si utilizza una siringa gastight da 10 microlitri Hamilton per iniettare la soluzione desiderata nel nervo ottico sezionato. È consigliabile un ago con bisellatura corta.

Caricare la siringa con 10 microlitri della soluzione da iniettare. Tipicamente plasmidi irna o vettori virali da iniettare afferrare il margine del nervo ottico con pinzette fine punta Dumont. Inserire l'estremità dell'ago nel nervo ottico, parallelamente al nervo.

Fino a quando il bevel non sarà più visibile, l’ago inserito sarà circondato su tutti i lati dal nervo. Una volta inserito l’ago, stringere delicatamente i lati del nervo con la pinzetta a punta fine e iniettare un quarto della soluzione ruotando la siringa. Un quarto di giro in senso orario o antiorario.

Continuare a ripetere questi passaggi fino a completare un'intera rotazione dell'ago ed esaurire completamente il contenuto della siringa. Rimuovere la punta della siringa dal nervo. Lasciare qualsiasi liquido iniettato che refluisce dal nervo all'interno dell'orbita, poiché formerà un ulteriore serbatoio per l'assorbimento da parte delle terminazioni degli assoni.

Riposizionare il contenuto orbitario nella sua posizione originale, chiudere la ferita e permettere all'animale di riprendersi. Dopo l'intervento chirurgico, gli animali devono essere alloggiati singolarmente. Gli analgesici post-chirurgici devono essere somministrati in base alle linee guida del vostro servizio di cura degli animali.

Le autorità e gli animali devono essere attentamente monitorati dopo l'intervento chirurgico. Come dimostrato in questo video, le cellule gangliari retiniche (RGC) possono essere direttamente bersagliate somministrando peptidi, farmaci, vettori, plasmidi o siRNA al moncone del nervo ottico reciso. In questo esempio rappresentativo, è stata eseguita una marcatura retrograda con fluoro gold ed è stata immediatamente iniettata nel nervo ottico la SI tre di peptidi marcati.

È stata quindi eseguita un'immagine in tempo reale della retina per evitare che i peptidi fuoriuscissero dal tessuto durante la fissazione, come mostrato qui: tre peptidi marcati con SI sono stati iniettati nel nervo ottico e trasportati in senso retrogrado fino ai sommi dei RGC nella retina. In questo esempio, tre siRNA marcati con SI sono stati iniettati nel moncone del nervo ottico. Immediatamente dopo la sezione del nervo ottico, è stata nuovamente eseguita l'immagine in tempo reale della retina: i tre siRNA marcati con SI iniettati nel nervo ottico sono stati trasportati in senso retrogrado dai RGC, come indicato dalla loro colocalizzazione.

Con la marcatura retrograda mediante FluoroGold, una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in pochi secondi se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante prestare attenzione per evitare di danneggiare la lente. Non dimenticare che lavorare con particelle virali può essere estremamente pericoloso, e le linee guida istituzionali per il lavoro con agenti biologici devono sempre essere seguite durante l'esecuzione di questa procedura.