Metodi per manipolazioni sperimentali dopo resezione del nervo ottico nel sistema nervoso centrale dei mammiferi

Le cellule gangliari retiniche o RG cs sono neuroni del sistema nervoso centrale che trasmettono informazioni visive dalla retina al cervello attraverso il nervo ottico. Nel video di accompagnamento, è stato dimostrato un metodo per essodomizzare o tagliare gli assoni dell'intera popolazione RGC come modello di morte delle cellule neurali apoptotiche nel sistema nervoso centrale adulto. In questo caso questo metodo è abbinato a procedure che mirano direttamente a fattori neurotrofici, RNA interferenti corti, plasmidi o vettori virali che codificano proteine anti ATO per le cellule gangliari retiniche danneggiate o per la retina per colpire la retina a livello globale.

Un apparato di iniezione intraoculare viene assemblato e utilizzato per iniettare sostanze nella camera vitrea dell'occhio per colpire specificamente le cellule gangliari retiniche. Viene posizionato Gelfoam o vengono utilizzate siringhe di Hamilton per iniettare sostanze nel nervo ottico. I risultati dell'imaging del moncone indicano che la sopravvivenza delle cellule gangliari retiniche può essere aumentata dalla somministrazione di fattori anti-apoptotici.

Utilizzando queste tecniche, questo metodo può essere utilizzato per identificare le proteine coinvolte nell'apoptosi dei neuroni adulti nel sistema nervoso centrale. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi della malattia del sistema nervoso centrale perché la transezione del nervo ottico è un modello riproducibile per l'apoptosi neuronale nel SNC adulto. Generalmente, chi è nuovo a questa tecnica fatica perché danneggia il cristallino quando inserisce la pipetta di vetro nella camera vitreale dell'occhio. Per preparare il sistema di siringhe per le iniezioni intraoculari, iniziare rimuovendo qualsiasi ago o dado RN.

Presente su una siringa Hamilton 1701 a tenuta di gas da 10 microlitri. Inserire il PFA feral nel fornacolo della coppa del picco del raccordo a compressione. Quindi inserire il raccordo completo nell'estremità della siringa e avvitare senza stringere il dado RN sulla parte superiore.

Inserire un'estremità di un tubo di picco da 16 pollici nel raccordo di compressione attraverso l'apertura del dado RN. Assicurarsi che il tubo del picco sia completamente inserito. Stringere il dado RN per comprimere il feral, che sigillerà il tubo del picco.

Ripetere questo processo su entrambe le estremità del doppio accoppiatore in vetro RN. Fissare l'estremità libera del tubo di picco a un'estremità del doppio accoppiatore in vetro RN serrando il supporto del dado RN. La micro pipetta di vetro formerà l'ago e il cilindro per il sistema di iniezione.

Inserire la pipetta di vetro nell'estremità libera dell'accoppiatore di vetro doppio RN. Serrare il dado RN per fissare la pipetta in posizione. Sotto un microscopio da dissezione, creare un puntale con il diametro appropriato tenendo una micropipetta tirata ad angolo e strofinando il puntale lungo la glassa di vetro di un vetrino per creare una rottura.

Idealmente, la punta finale dovrebbe essere leggermente smussata. Successivamente, utilizzando un kit di adescamento di Hamilton Syringe Company riempito con siringa, linker per tubi di picco, doppio accoppiatore in vetro RN e micropipetta in vetro con olio minerale per l'uso. Con il sistema di iniezione idraulica, sostituire l'ago con un ago Hamilton 9 0 0 3 0.

Quindi posizionare un setto di gomma sopra l'ago Hamilton 9 0 0 3 0 per fornire una tenuta durante l'iniezione dell'olio minerale. Inserire l'ago Hamilton 9 0 0 3 0 della siringa di adescamento nella parte posteriore del cilindro della siringa Hamilton da 10 microlitri del sistema di iniezione. Premere saldamente il setto contro l'estremità della siringa per creare un sigillo.

Premere lentamente lo stantuffo l'olio minerale passerà attraverso gli elementi in vetro del sistema di iniezione. Riempimento della pipetta di vetro. Spingere tutto l'olio attraverso il sistema di iniezione per rimuovere eventuali bolle d'aria lungo il tratto.

Se la siringa di riempimento sta esaurendo l'olio minerale, estrarre lentamente l'ago mentre eroga costantemente l'olio. Per evitare la formazione di bolle d'aria, riempire nuovamente la siringa di adescamento e iniettare nuovamente. Quando l'intero sistema è riempito di olio minerale, inserire lo stantuffo originale del 10 microlitro.

La siringa di Hamilton preme completamente lo stantuffo per rimuovere l'olio minerale aggiuntivo dal sistema. Pulire la micropipetta di vetro e l'estremità della siringa. Con il 70% di etanolo, estrarre lo stantuffo fino al segno di due microlitri sulla canna.

L'estremità della micropipetta di vetro si riempirà d'aria, fornendo una zona cuscinetto tra l'olio minerale e il fluido da iniettare. Riempire il cilindro della pipetta posizionando l'estremità della micropipetta nella soluzione desiderata ed estraendo lo stantuffo della siringa di Hamilton. Non più di quattro o cinque microlitri di soluzione verranno iniettati in un occhio di ratto adulto per eseguire l'iniezione intraoculare.

Iniziare commutando il flusso di gas all'attacco della maschera antigas per il telaio stereotassico. Quindi posizionare un ratto anestetizzato con fluoro nell'apparato stereotassico. Abbassare la concentrazione di fluoro al 2% e monitorare l'anestesia.

Copri l'animale con una coperta chirurgica. Per mantenere la temperatura corporea durante l'intervento, aprire le palpebre e posizionare una goccia di soluzione anestetica acan. Sulla superficie della cornea l'iniezione richiede due persone, una per inserire la pipetta di vetro nella camera vitreale e mantenere la posizione della pipetta.

E un altro per premere lo stantuffo sulla siringa, che eroga la soluzione desiderata. Sotto un microscopio operatorio, afferrare la micropipetta di vetro e il doppio accoppiatore di vetro RN, allargare le palpebre formando una forma a V di fronte al sito di iniezione Con le dita, l'occhio si solleverà fuori dall'orbita. Inserire delicatamente la punta della micropipetta di vetro attraverso l'area priva di vasi sanguigni e attraverso la sclera con un angolo verso il basso.

Quando la pipetta penetra nella sclera, si avverte un piccolo schiocco. La persona che tiene la siringa dovrebbe ora iniettare quattro microlitri di soluzione premendo lo stantuffo fino al segno di due microlitri sulla siringa. L'iniezione dovrebbe durare circa uno o due secondi.

La soluzione iniettata con successo fluirà attraverso la camera vitreale, manterrà ferma la micropipetta per circa cinque secondi e quindi si ritirerà nella stessa direzione Quando l'ago è stato inserito, la congiuntiva sbatterà all'indietro sopra la piccola apertura, aiutando a sigillare la puntura sclerale. Una volta completato l'intervento chirurgico, spegnere l'isof fluoro e lasciare che l'animale respiri ossigeno per diversi minuti. Coprire la superficie della cornea con un unguento oftalmico per gli occhi Al fine di prevenire l'essiccazione della cornea durante il recupero, rimuovere l'animale dal dispositivo stereotassico e rimetterlo nella gabbia di recupero.

Manipolare le cellule gangliari retiniche attraverso il trasporto retrogrado dopo esotomia. Per prima cosa eseguire una transezione del nervo ottico secondo le istruzioni nel protocollo di transezione del nervo ottico video di accompagnamento, 2, 2, 4, 1 farmaci traccianti. Plasmidi, siRNA o vettori virali possono essere applicati al moncone del nervo ottico.

Esistono due metodi principali per eseguire questa procedura: utilizzando schiuma di gel o iniezione diretta nel nervo ottico. Se si utilizza il metodo della schiuma gel, assicurarsi che le cellule gangliari retiniche siano state pre-marcate iniettando traccianti retrogradi nel collicolo superiore una settimana prima della tassonomia. Immediatamente dopo che il nervo ottico è stato tagliato, posizionato un piccolo pezzo di schiuma di gel imbevuto della soluzione sperimentale sopra il moncone del nervo ottico sezionato, il contenuto orbitale viene quindi riportato nella posizione precedente.

Quando l'occhio viene riportato in posizione neutra, usa una pinza per spingere il pezzo di schiuma gel verso il basso nell'orbita, assicurandoti che rimanga sopra l'estremità del nervo ottico. La tecnica di iniezione è più efficace per la somministrazione di sostanze che devono accedere al citoplasma dell'assone per essere trasportate retroattivamente dal flusso opplasmatico, una siringa di Hamilton da 10 microlitri a tenuta di gas viene utilizzata per iniettare la soluzione desiderata nel nervo ottico sezionato. È auspicabile un ago con uno smusso corto.

Caricare la siringa con 10 microlitri della soluzione da iniettare. Tipicamente plasmidi irna o vettori virali per iniettare afferrare il bordo del nervo ottico con pinze dumont a punta fine. Inserire l'estremità dell'ago nel nervo ottico, parallelamente al nervo.

Fino a quando lo smusso non è più visibile, l'ago inserito sarà racchiuso su tutti i lati dal nervo. Una volta inserito l'ago, schiacciare delicatamente i lati del nervo con la pinza a punta sottile e iniettare un quarto della soluzione ruotando la siringa. Un quarto di giro in senso orario o antiorario.

Continui a ripetere questi passaggi fino a quando non è stata completata una rotazione completa dell'ago e l'intero contenuto della siringa è stato iniettato. Rimuovere la punta della siringa dal nervo. Lasciare qualsiasi fluido iniettato che ha reflusso dal nervo all'interno dell'orbita in quanto ciò formerà un pool aggiuntivo per l'assorbimento da parte delle estremità degli assoni.

Riportare il contenuto orbitale nella posizione originale, chiudere la ferita e consentire all'animale di riprendersi. Gli animali devono essere alloggiati in modo indipendente dopo l'intervento chirurgico. Gli analgesici post-chirurgici devono essere somministrati secondo le linee guida della cura degli animali.

Le autorità e gli animali devono essere attentamente monitorati dopo l'intervento chirurgico. Come dimostrato in questo video, l'RGC può essere bersagliato direttamente somministrando peptidi, farmaci, vettori, plasmidi o siRNA al moncone del nervo ottico sezionato. In questo esempio rappresentativo, è stata eseguita la marcatura retrograda dell'oro fluoro e i peptidi marcati con SI tre sono stati immediatamente iniettati nel nervo ottico.

L'imaging dal vivo della retina è stato quindi eseguito per evitare che i peptidi fuoriuscissero dal tessuto durante la fissazione, come si può vedere qui, i peptidi marcati SI tre iniettati nel nervo ottico sono stati retro, notevolmente trasportati indietro al somato RGC nella retina. In questo esempio, tre siRNA marcati SI sono stati iniettati nel moncone del nervo ottico. Immediatamente dopo la tassonotomia e l'imaging dal vivo della retina sono stati eseguiti di nuovo, i siRNA marcati SI three iniettati nel nervo ottico sono stati retrogradi, trasportati da RG CS come indicato dalla loro colocalizzazione.

Con l'etichettatura retrograda al fluoro Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in pochi secondi se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante fare attenzione a non danneggiare l'obiettivo. Non dimenticare che lavorare con particelle virali può essere estremamente pericoloso e le linee guida istituzionali per lavorare con i rischi biologici dovrebbero sempre essere seguite durante l'esecuzione di questa procedura.