Ad alta risoluzione in fibra ottica per Microendoscopy In situ Cellular Imaging

Tradizionalmente, gli studi biologici e clinici che richiedono l'analisi microscopica a livello cellulare sono stati eseguiti eseguendo più esperimenti in parallelo con singoli campioni rimossi dallo studio in tempi sequenziali. Punti per la valutazione mediante microscopia ottica, mentre la microscopia confocale, multifotone e seconda armonica sono tutte tecniche utili per l'imaging in situ. L'infrastruttura richiesta è complessa e costosa e coinvolge sistemi laser a scansione e sorgenti luminose complesse. Qui dimostriamo come costruire un sistema di microendoscopio in fibra ottica ad alta risoluzione in un solo giorno, utilizzando componenti standard per meno di 5.000 dollari USA.

La piattaforma offre flessibilità in termini di risoluzione dell'immagine, campo visivo e lunghezza d'onda operativa. Innanzitutto, viene assemblato un semplice telaio per microscopio a epifluorescenza per ospitare una sorgente luminosa, lenti con filtri ottici, un fascio di fibre ottiche e una telecamera CCD. Successivamente, vengono installate le lenti di imaging, che formano un'immagine ingrandita del fascio di fibre ottiche sulla telecamera CCD.

Una sorgente LED viene quindi installata con ottiche di illuminazione per fornire luce di eccitazione fluorescente al campione. Infine, con il microendoscopio assemblato, l'imaging in tempo reale rivela i dettagli a livello cellulare di campioni marcati in fluorescenza, comprese le colture in vitro, i modelli animali in vivo e i soggetti umani. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia confocale o multifotonica, è che è sufficientemente semplice ed economica in modo che i ricercatori che lavorano in una vasta gamma di campi possano implementarla rapidamente e personalizzarla per soddisfare le loro esigenze specifiche.

Il microendoscopio ad alta risoluzione qui descritto deve essere considerato come una configurazione di base con diverse varianti possibili nell'assemblaggio e nell'applicazione. Nella selezione dei componenti per un'applicazione specifica, considerare le relazioni intrinseche coinvolte nella microscopia a fluorescenza tra concentrazione di fluorolo, illuminazione fotosbiancante, intensità, sensibilità della fotocamera, guadagno e tempo di esposizione. Questa piattaforma è progettata per essere utilizzata con la pro flavina come mezzo di contrasto fluorescente, ma può essere configurata per funzionare con altri coloranti fluorescenti.

La pro flavina è un colorante a nucleo brillante con lunghezze d'onda di picco di assorbimento ed emissione rispettivamente di 445 nanometri e 515 nanometri. L'uso di altri agenti di contrasto richiederà all'utente di selezionare l'eccitazione, l'emissione e i filtri dicroici in modo appropriato per assemblare il sistema di microendoscopio, iniziare collegando due aste della gabbia da sei pollici a due aste della gabbia da 1.5 pollici per formare una coppia di aste lunghe 7.5 pollici. Avvitare le aste su una faccia dell'unità specchio pieghevole, quindi installare uno specchio di un pollice di diametro.

Quindi, avvitare quattro aste da 0,5 pollici nella faccia opposta dell'unità specchio pieghevole. Far scorrere il cubo della gabbia sulle aste della gabbia da 7,5 pollici attraverso i due fori passanti inferiori. Avvitare le aste da due pollici nella faccia laterale del cubo della gabbia.

Utilizzando un adattatore da C Mount a SM One, fissare la telecamera a una piastra a gabbia. Fissare la piastra della gabbia sulle aste della gabbia da 0,5 pollici a filo con la parte anteriore dell'unità specchio pieghevole. Selezionare una lente tubolare di un pollice di diametro per formare un'immagine del fascio di fibre ottiche sulla telecamera.

La lunghezza focale della lente deve essere selezionata in modo tale che la causa del fascio di fibre ottiche sia campionata da almeno due pixel. Quando viene ripreso sulla fotocamera, inserire l'obiettivo in un tubo dell'obiettivo lungo tre pollici e fissare l'obiettivo con un anello di sicurezza. Una chiave inglese è utile per avvitare gli anelli di sicurezza nei lunghi tubi delle lenti.

Far cadere il filtro di emissione nel tubo dell'obiettivo da tre pollici sopra il primo anello di ritegno e aggiungere un altro anello per fissare il filtro in posizione. Assicurarsi che l'orientamento del filtro soddisfi la convenzione indicata dal produttore del filtro. Avvitare il tubo dell'obiettivo sul lato del cubo a gabbia più vicino alla telecamera CCD.

Questa posizione è mostrata anche qui. Si noti che nel diagramma, questa lente e il filtro sono mostrati senza tubo dell'obiettivo da tre pollici. Per chiarezza, collegare la fotocamera a un computer e visualizzare l'immagine sullo schermo.

Dirigere il gruppo gabbia verso un oggetto distante e far scorrere il cubo gabbia lungo le guide finché non appare a fuoco un'immagine dell'oggetto. Utilizzare un cacciavite per serrare le quattro viti situate ai lati del cubo della gabbia. Queste viti afferrano le guide quando vengono serrate tenendo il cubo in posizione.

Ciò garantirà che le lenti del tubo formino un'immagine focalizzata del fascio di fibre sulla fotocamera quando combinate con la lente dell'obiettivo corretta all'infinito. Quindi, inserisci lo specchio diic nel supporto e posizionalo a 45 gradi nel cubo della gabbia. Avvitare la lente dell'obiettivo tramite un adattatore filettato da RMS a SM e un tubo della lente regolabile nella parte anteriore del cubo della gabbia di fronte al supporto della lente del tubo.

Successivamente, avvitare un connettore SMA in una piastra a gabbia e montarlo sulle aste approssimativamente alla distanza di lavoro della lente dell'obiettivo. Aggiungi la piastra di base e il tappo terminale ai lati aperti del cubo a gabbia. Quindi montare un LED su una piastra a gabbia e farlo scorrere all'estremità delle aste da due pollici.

Aggiungi una lente a un tubo dell'obiettivo da 0,5 pollici in modo tale che quando questo tubo viene avvitato nel lato del cubo della gabbia, formerà un'immagine del LED che riempie l'apertura posteriore dell'obiettivo. Inoltre, aggiungi il filtro di eccitazione al tubo dell'obiettivo. In questa fase, è possibile utilizzare un driver LED per controllare l'intensità della luce illuminante utilizzando la resina epossidica.

Collegare un connettore SMA per una fibra da 1030 micron al fascio di fibre ottiche con campo visivo di 720 micron. Per i dettagli sulla connettorizzazione in fibra ottica, fare riferimento ai laboratori T Thor, codice FN nove sei. Una guida alla connettorizzazione e alla lucidatura delle fibre ottiche.

Avvitare il fascio di occhielli del connettore SMA nella presa SMA montata sulla gabbia Le aste dirigono l'estremità distale del fascio verso una sorgente luminosa a banda larga, sarà sufficiente un'illuminazione fluorescente. Quindi osservare l'immagine della faccia prossimale del fascio sulla telecamera CCD. Infine, regolare la posizione della lente dell'obiettivo avvitando o svitando il cubo della gabbia.

Fino a quando l'immagine del fascio di fibre non appare a fuoco, la causa individuale dovrebbe essere chiaramente visibile. La risoluzione spaziale del microendoscopio può essere aumentata collegando una micro lente o un gruppo di lenti alla punta distale del fascio di fibre. Queste ottiche sono configurate in modo tale che, invece di posizionare la punta del fascio direttamente sul tessuto, la punta venga ripresa sulla superficie del tessuto con un ingrandimento dem.

Aumentando così la frequenza di campionamento spaziale imposta dalla causa di guida della luce del fascio di fibre. Il grado di ingrandimento dem corrisponde all'aumento della risoluzione spaziale e, allo stesso tempo, ad una proporzionale diminuzione del campo visivo. Seleziona una lente Grin con l'ingrandimento e la distanza di lavoro desiderati per la tua applicazione.

Assicurarsi che il diametro della lente corrisponda a quello del fascio di fibre. Prevedi di lavorare con. Monta il fascio di fibre e la lente del ghigno su stadi di posizionamento manuale a tre assi separati sotto un microscopio a bassa potenza o uno stereoscopio per un allineamento accurato.

Quindi posizionare una goccia di adesivo ottico sulla lente o sulla faccia del fascio. Utilizzando i posizionatori manuali, portare i due componenti a contatto. Esporre l'interfaccia alla luce UV per la dose consigliata dal produttore per polimerizzare l'adesivo.

Per proteggere la lente del sorriso e l'interfaccia incollata, utilizzare un breve tratto di tubo capillare in alluminio per racchiudere il giunto. Far scorrere il tubo sul giunto e fissarlo in posizione con la goccia di resina epossidica a ciascuna estremità del tubo, utilizzare tubi termorestringenti per completare l'assemblaggio. Prima dell'imaging microendoscopico, applicare l'agente di contrasto sulle cellule o sul tessuto da visualizzare per l'imaging delle cellule e della coltura.

Per prima cosa, rimuovere i terreni di coltura di peppe. Quindi aggiungere la soluzione di pro flavina pipettando delicatamente nel pozzetto. Dopo una breve incubazione della durata massima di un minuto, rimuovere la soluzione di pro flavina con peppe e gettarla.

Sciacquare le celle aggiungendo e rimuovendo la soluzione PBS fresca nel pozzetto, montare l'estremità distale del fascio di fibre in un dispositivo sicuro con stadi di posizionamento manuale sugli assi x, Y, Z per la stabilità. Durante l'imaging dopo l'applicazione del colorante su cellule o tessuti, posizionare il fascio di fibre ottiche a contatto leggero con il campione. Visualizzare l'immagine del pacchetto in fibra ottica sullo schermo del computer, utilizzando il software fornito dal produttore della fotocamera o qualsiasi software personalizzato che si desidera sviluppare.

Regolare il tempo di esposizione e le impostazioni di guadagno della fotocamera per ottenere un'immagine di luminosità accettabile. Se assemblato correttamente, il micro endoscopio funzionerà come un microscopio a epifluorescenza trasmesso attraverso un fascio di fibre ottiche coerenti. Per ottenere risultati ottimali di imaging, è necessario prestare attenzione a garantire che siano soddisfatte tre condizioni chiave.

In primo luogo, la faccia prossimale del fascio di fibre deve essere ripresa sulla telecamera CCD senza sfocatura per ottenere la piena risoluzione del sistema. Qui. Una porzione di un fascio di fibre viene ripresa con scarsa messa a fuoco, leggermente a fuoco e buona messa a fuoco. La messa a fuoco ottimale si trova regolando la posizione effettiva della lente dell'obiettivo rispetto alla faccia del fascio.

In secondo luogo, la faccia prossimale del fascio di fibre deve essere illuminata uniformemente su tutto il suo diametro. Come descritto in precedenza, ciò si ottiene configurando l'ottica di illuminazione per l'illuminazione a cola. L'immagine mostrata qui è stata acquisita quando un campione fluorescente uniforme viene illuminato in questa configurazione preferita.

Qui viene mostrato il risultato corrispondente in condizioni di illuminazione critica. La struttura del LED viene riprodotta sulla faccia del fascio di fibre, determinando l'aspetto di questo modello indesiderato sovrapposto alla vera struttura del campione. In terzo luogo, è importante assicurarsi che sia la faccia prossimale che quella distale del fascio di fibre siano pulite e prive di graffi e scheggiature.

In questo esempio, i detriti dell'immagine sono attaccati alla faccia del fascio e il danno sotto forma di un piccolo chip a ore cinque è visibile sul perimetro della fibra. I detriti possono essere rimossi dalle facce del fascio pulendoli allo stesso modo dei connettori in fibra ottica convenzionali con carta per lenti e isopropanolo o strumenti di pulizia standard per fibre ottiche. 1483 cellule sono state marcate con Pro flavina e il fascio di fibre nude è stato leggermente posizionato sul campione.

L'imaging in vitro è mostrato qui: quando una lente 2,5 x grin è stata incollata alla punta del fascio, è stato ottenuto un miglioramento della risoluzione spaziale e una riduzione del campo visivo. L'imaging in vivo in cui un fascio di fibre con un diametro esterno di 0,5 millimetri è stato fatto passare attraverso un ago calibro 21 e fatto avanzare in un tessuto adiposo mammario di topo è stato eseguito come si vede in questo filmato, gli adipociti sono chiaramente visibili con il movimento dovuto al ciclo cardiaco. In questo esempio, l'imaging della mucosa orale in un volontario umano sano è stato eseguito utilizzando un fascio di fibre più grande con un diametro esterno di 1,5 millimetri.

In tutti gli esempi, la pro flavina è stata utilizzata come agente di contrasto fluorescente per la marcatura nucleare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare e assemblare un microendoscopio in fibra ottica per l'imaging a fluorescenza in C due di cellule e tessuti.