Name: Ad alta risoluzione in fibra ottica per Microendoscopy In situ Cellular Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T22:01:00.000+00:00
Duration: 13 min 49 s
Description: Impara a costruire un microendoscopio a fibra ottica ad alta risoluzione per imaging cellulare in situ. Questo sistema economico permette imaging in tempo reale in vitro, in vivo e su soggetti umani.

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Questa ricerca è stata in parte finanziata dal National Institutes of Health, concedere R01 EB007594, il Dipartimento del Programma di Ricerca sul Cancro Seno Difesa, proposta BCO74699P7, e la Susan G. Komen Foundation concedere 26152/98188972.

1. Microendoscope Assemblea L'alta risoluzione microendoscope qui descritto (figura 1a) dovrebbe essere considerata come una configurazione di base con diverse variazioni possibili in assemblea e di applicazione. Descriviamo in dettaglio in questa sede l'incarnazione della piattaforma che è stato progettato per essere utilizzato con proflavina come agente di contrasto fluorescente. Proflavina nucleare è un luminoso macchia con l'assorbimento di picco e lunghezze d'onda di emissione di 445 nm e 515 nm rispettivamente. L'uso di altri mezzi di contrasto richiede all'utente di selezionare eccitazione, emissione e filtri dicroici in modo appropriato. Diversi elementi di alta risoluzione microendoscope sono generici e possono essere ottenute da fornitori diversi. Per esempio, i componenti di posizionamento optomechanical sono disponibili da Thorlabs, Newport, Linos tra gli altri. Compatte telecamere CCD sono disponibili da aziende quali Point Grey Research, Prosilica e Retiga; sensibilità della telecamera deve essere scelto tenendo in considerazione la luminosità del fluoroforo da utilizzare, così come il frame rate desiderato. Ad alta potenza diodi emettitori di luce (LED) possono essere ottenuti da Luxeon, Cree, e Nichia tra gli altri. Fasci di fibre ottiche sono disponibili da Sumitomo, Fujikura, e Schott. Nella scelta dei componenti per una specifica applicazione, l'utente deve prendere in considerazione le relazioni inerenti coinvolti in microscopia a fluorescenza tra la concentrazione di fluoroforo, photobleaching, intensità di illuminazione, la sensibilità della telecamera, il guadagno e tempo di esposizione. <ol><li> Collegare i 6 "gabbia di aste al 1,5" aste gabbia, per formare una coppia di 7.5 "aste lunghe. Avvitare queste aste in una faccia dell'unità specchio piega. Avvitare il 0,5" aste in faccia opposta. Far scorrere il cubo gabbia sulle aste gabbia, tramite il basso due fori passanti. Avvitare le 2 "aste in faccia lato del cubo gabbia (figura 1b). </li><li> Fissare la fotocamera a un piatto gabbia utilizzando un C-mount adattatore SM1. Fissare la piastra gabbia sul 0,5 "aste gabbia, a filo con la faccia dell'unità specchio piega. </li><li> Inserire l'obiettivo "tubo" in un "3 tubo lente lungo e sicuro l'obiettivo con un anello di sicurezza. La lunghezza focale dell'obiettivo dovrebbero essere selezionati in modo che il core della fibra ottica fascio sono campionati da almeno due pixel quando proiettato sulla fotocamera. Rilasciare il filtro per le emissioni nel tubo sulla parte superiore del primo anello di sostegno, e aggiungere un altro anello per fissare il filtro in posizione. Osservare la convenzione filtro orientamento indicato dal produttore del filtro. Avvitare il tubo lente nella parte del gabbia cubo più vicino alla fotocamera CCD. noti che nella figura 1c, questo obiettivo e filtro sono riportate senza il "3 tubi lente per chiarezza. </li><li> Collegare la fotocamera a un computer e visualizzare l'immagine sullo schermo. Diretto il gruppo telaio ad un oggetto distante e far scorrere il cubo gabbia lungo i binari fino a quando l'immagine appare a fuoco. Bloccare il cubo gabbia in questa posizione. (Questo è un metodo semplice per garantire che la lente del tubo formerà una immagine messa a fuoco quando combinato con l'infinità-corretti lente dell'obiettivo). </li><li> Inserire lo specchio dicroico nel supporto e posto a 45 ° nel cubo gabbia. </li><li> Avvitare l'obiettivo, attraverso un RMS per SM1 adattatore filettato e tubo lente regolabile, nella faccia del cubo gabbia di fronte al tubo porta-lente. A z-traduttore può essere usato al posto del tubo lente regolabile per facilitare la messa a fuoco. Vite di un connettore SMA in un piatto e montare questa gabbia sulle aste, a circa la distanza di lavoro della lente obiettiva. </li><li> Montare un LED su un piatto gabbia e far scorrere sulla fine del 2 "aste. Aggiungere una lente ad un 0,5" tubo lenti in modo che quando questo tubo è avvitato nel lato del cubo gabbia, formerà l'immagine del LED che riempie l'apertura posteriore della lente obiettiva. Questo (Kohler illuminazione) di configurazione in modo che la faccia prossimale del fascio di fibre ottiche è uniformemente illuminato. Aggiungere il filtro di eccitazione al "0,5 tubo lente e fissarlo in posizione con un anello di sicurezza (figura 1c). </li><li> Collegare un connettore SMA ad un fascio di fibre ottiche. Avvitare il fascio di connettore SMA nella presa SMA montati sulle aste gabbia. Diretta l'estremità distale del fascio verso una sorgente di luce a banda larga (illuminazione fluorescente è sufficiente) e osservare l'immagine del volto fascio prossimale sulla fotocamera CCD. Regolare la posizione della lente obiettivo avvitando dentro o fuori del cubo gabbia fino a quando il fascio di fibre immagine appare a fuoco. I singoli core dovrebbe essere chiaramente visibile (Figura 2). </li></ol> 2. GRIN Lens Assemblea La risoluzione spaziale del microendoscope può essere aumentata collegando un micro-lente o gruppo ottico alla punta distale del fascio di fibre. Queste ottiche sono configurati in modo tale che invece di mettere la punta pacco direttamente sul tessuto, la punta è ripreso sulla superficie del tessuto con demagnification, aumentando così la frequenza spaziale di campionamento imposto dalla luce-guidnuclei zione del fascio di fibre. Il grado di demagnification corrisponde l'aumento della risoluzione spaziale, e allo stesso tempo, ad una diminuzione proporzionale nel campo di vista. Componenti lente gradiente di indice (GRIN) sono compatibili con fibre ottiche e sono disponibili da GrinTech, NSG, Schott, tra gli altri, e può essere direttamente legato alla punta distale di un fascio di fibre. <ol><li> Seleziona una lente GRIN con l'ingrandimento desiderato e distanza di lavoro per l'applicazione. Assicurarsi che il diametro della lente è superiore a quella del fascio di fibre che si intende lavorare. È consigliabile che il fascio di fibre ottiche e lenti GRIN essere montato sui palcoscenici manuale separato 3-asse di posizionamento al microscopio a bassa potenza o stereoscopio per l'allineamento preciso prima dell'incollaggio. </li><li> Mettere una goccia di adesivo ottico (es. adesivi UV Noland cura) su entrambi l'obiettivo o il viso fascio. Portare i due componenti in contatto utilizzando la posizionatori manuale. Esporre l'interfaccia ai raggi UV per la dose raccomandata dal produttore. </li><li> Per proteggere la lente GRIN e all'interfaccia collegata, un breve tratto di tubo in alluminio capillare (parti piccole Inc.) possono essere utilizzate per racchiudere il comune. Far scorrere il tubo sopra il giunto e fissarlo in posizione con resina epossidica. Guaina termorestringente può essere utilizzato per completare l'assemblaggio. </li></ol> 3. Microendoscope Imaging <ol><li> Applicare il mezzo di contrasto alle cellule o tessuti da acquisire. Con proflavina (0,01% w / v in PBS), nella diagnostica per immagini in vitro di cellule in coltura può essere effettuata mediante incubazione breve (&lt;1 minuto) e un accurato risciacquo. Imaging di ex campioni di tessuto vivo o in tessuti in vivo è possibile dopo l'applicazione topica del colorante. La diffusione delle proflavina in queste condizioni è stato trovato per essere quasi istantanea, con l'imaging possibile in pochi secondi e duratura per diversi minuti. </li><li> Posizionare il fascio di fibre ottiche in leggero contatto con il campione da acquisire. Quando le cellule in coltura di imaging o ex campioni di tessuto vivo, è consigliato il montaggio della parte distale del fascio di fibre in un dispositivo di sicurezza con le fasi di posizionamento manuale sugli assi XYZ per la stabilità durante l'imaging. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Quando assemblate correttamente, il microendoscope opererà come un epi-microscopio a fluorescenza, diffusa attraverso un coerente fibra ottica fascio. Per ottenere risultati ottimali di imaging, l'attenzione dovrebbe essere rivolta a garantire che le tre condizioni fondamentali requisiti: <ol><li> La faccia prossimale del fascio di fibre dovrebbe essere ripreso sul CCD senza defocus, al fine di ottenere la risoluzione completa del sistema. Figura 2a, b, c dimostrare una porzione di un fascio di fibre ripreso con scarsa attenzione, defocus leggera e buona messa a fuoco, rispettivamente. La messa a fuoco ottimale si trova regolando la posizione assiale della lente obiettivo relativo al viso bundle. </li><li> La faccia prossimale del fascio di fibre dovrebbe essere uniformemente illuminata oltre il suo diametro totale (campo di vista). Come descritto nel testo del protocollo (1,7), ciò si ottiene mediante la configurazione delle ottiche di illuminazione per l'illuminazione di Kohler. Figura 2d mostra un'immagine acquisita quando un campione uniforme fluorescente è illuminato in questa configurazione preferita, con 2e figura dimostrando il corrispondente risultato in condizioni di illuminazione critiche. In quest'ultimo caso, la struttura del LED è ripreso sul viso fascio di fibre, con la conseguente comparsa di questo modello indesiderate sovrapposto alla struttura del campione vero. </li><li> Entrambe le facce prossimale e distale del fascio di fibre devono essere pulite e prive di graffi e patatine. Figura 2f dimostra la presenza di detriti attacca alla faccia fagotto, con un danno sotto forma di un piccolo chip alle 5 sul perimetro fibra. Detriti possono essere rimossi dal fascio volti pulendo allo stesso modo come convenzionale connettori a fibre ottiche, con carta per lenti e isopropanolo, o standard in fibra ottica strumenti di pulizia. Se una delle estremità del fascio di fibre è graffiato o tagliato, o se il fascio rompe lungo la sua lunghezza, il volto può essere lucido piatto da manuale standard, o tecniche di lucidatura meccanica. Si consiglia di 12-15 micron lappatura della carta per una lucidatura iniziale ruvido, con un tocco finale su carta 0,5-1,0 micron. </li></ol> Figura 3a mostra immagini di 1483 cellule in vitro, a seguito di etichettatura con il posizionamento proflavina e la luce del fascio di fibre nude sul campione. Figura 3b mostra il miglioramento della risoluzione spaziale e la riduzione del campo di visualizzazione fornita da una lente GRIN 2.5x legato alla punta bundle. Movie 1 dimostra imaging in vivo del cuscinetto di grasso mammario in un modello murino. Qui, un fascio di fibre con 0,5 mm di diametro esterno (330 micron campo di vista) era passato attraverso un ago da 21 gauge e avanzato nel tessuto. Le cellule adipose sono ben visibili, con movimento a causa del ciclo cardiaco apparente in questa acquisizione a 15fotogrammi al secondo. Figura 3c mostra immagini della mucosa orale in un volontario sano, questa volta utilizzando un fascio di fibre più grande, con 1,5 mm di diametro esterno (1,4 mm campo di vista). In tutti gli esempi mostrati, proflavina è stato usato come agente di contrasto nucleare marcatura fluorescente. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Assemblaggio ad alta risoluzione microendoscope (HRME). (A) Schema del sistema HRME. (B) Montaggio della struttura principale di supporto optomechanical. (C) aggiunta di elementi ottici, illuminazione a LED, e camera CCD. (D) Fotografia del sistema HRME, confezionato in un 10 "x 8" x "recinto 2.5. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Impostazione del HRME. Esempi di immagini con la fibra ottica in fascio (a) scarsa attenzione, (b) vicino ad una buona messa a fuoco, (c) messa a fuoco ideale. In (d), un obiettivo uniforme fluorescente all'estremità distale del pacchetto è ripreso sotto Kohler (uniforme) illuminazione. (E) Un obiettivo uniforme fluorescenti ripreso in condizioni di illuminazione critiche, con la struttura sorgente apparente sull'oggetto. (F) i tessuti e le cellule allentati possono aderire al viso fascio di fibre, che è anche soggetto a danni minori alla sua periferia. <img src="/files/ftp_upload/2306/2306fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Imaging con il HRME. (A) 1483 cellule in vitro, ripreso con un fascio di fibre nude (IGN-08/30) a seguito di etichettatura con proflavina 0,01% (w / v). (B) Lo stesso 1483 la coltura cellulare come mostrato in (a), ripreso con un fascio di fibre ottiche con lente GRIN 2.5x allegato. (C) Immagine di normale mucosa orale umana in vivo, a seguito di applicazione topica di proflavina 0,01% (w / v). Movie 1. Imaging il cuscinetto di grasso mammaria di un topo mediante inserimento di un bundle 450 diametro esterno in fibra di micron all'interno del lume di una 21-gauge passato nel tessuto. Proflavina 0,01% (w / v) è stato consegnato al sito di immagini attraverso lo stesso ago prima dell'inserimento della fibra di imaging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2306/5-11-1%202306_Pierce_movie1.avi">Clicca qui per guardare il video</a>

<ol><li>Pierce, M. C., Javier, D. J., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+contrast+agents+and+imaging+systems+for+detection+and+diagnosis+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optical contrast agents and imaging systems for detection and diagnosis of cancer.</a> Int. J. Cancer. 123, 1979-1990 (2008).</li>
<li>Muldoon, T. J., Pierce, M. C., Nida, D. L., Williams, M. D., Gillenwater, A., Richards-Kortum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular-resolution+molecular+imaging+within+living+tissue+by+fiber+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy.</a> Opt. Express. 15, 16413-16423 (2007).</li>
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<li>Udovich, J. A., Kirkpatrick, N. D., Kano, A., Tanbakuchi, A., Utzinger, U., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Appl. Opt. 47, 4560-4568 (2008).</li>
<li>Barretto, R. P. J., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nat. Methods. 6, 511-512 (2009).</li>
<li>Rouse, A. R., Kano, A., Udovich, J. A., Kroto, S. M., Gmitro, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+demonstration+of+a+miniature+catheter+for+a+confocal+microendoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Design and demonstration of a miniature catheter for a confocal microendoscope.</a> Appl. Opt. 43, 5763-5771 (2004).</li>
<li>Kester, R. T., Christenson, T., Richards-Kortum, R., Tkaczyk, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+cost%2C+high+performance%2C+self-aligning+miniature+optical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Opt%22%5BJournal%5D)">Low cost, high performance, self-aligning miniature optical systems.</a> Appl. Opt. 48, 3375-3384 (2009).</li>
</ol>

MP e DY non hanno nulla da rivelare. RRK detiene brevetti relativi a piattaforme di imaging microendoscopica.

La tecnica ad alta risoluzione microendoscopy qui descritta fornisce ricercatori nel campo della ricerca biomedica di base e clinica con un metodo flessibile, robusta e conveniente per la visualizzazione dei dettagli cellulari in situ. Abbiamo descritto un protocollo per il montaggio del sistema di imaging e dimostrato il suo impiego in colture cellulari in vitro e in animali e tessuti umani in vivo. Mentre i risultati delle immagini qui presentate proflavina usato come agente di contrasto fluorescente, altri gruppi hanno dimostrato le versioni del sistema di illuminazione a LED con lunghezze d&#39;onda e filtri scelti per abbinare eccitazione / emissione spettri di altri coloranti 5-7. Risoluzione e campo di vista sono inizialmente determinati dal core-to-core spaziatura e il diametro di imaging della fibra ottica fascio. Abbiamo utilizzato fasci di circa 4 micron nucleo-core spaziatura, l&#39;imaging e diametri di 330 micron (filmato 1), 720 micron (Figura 2, Figura 3a, b), e 1400 micron (Figura 3c). I fasci più piccoli che possono essere passate aghi calibro più stretto e sono molto più flessibili rispetto alle fibre più grandi. Noi e gli altri 8 hanno, in alcuni casi, ha osservato la comparsa di emissioni di autofluorescenza dalla fibra stessa bundle. Quando si tenta di eccitare fluorofori a lunghezze d&#39;onda UV, o raccogliere emissione nella gamma spettrale rosso, l&#39;attenzione dovrebbe essere prestata al livello di autofluorescenza fascio di fibre che contribuiscono al segnale complessivo misurato. Mentre la maggior parte del lavoro ad alta risoluzione microendoscopy segnalato fino ad oggi hanno utilizzato un fascio di fibre nudo, un ingrandimento extra può essere fornito da uso di lenti GRIN legato alla punta distale. Le lenti GRIN offrono un modo semplice ed economico per aumentare la risoluzione spaziale, anche se la loro suscettibilità alle aberrazioni ottiche e limitato NA è ben riconosciuta. Se l&#39;obiettivo delle prestazioni GRIN è inadeguata per una particolare applicazione, GRIN ibrido / obiettivi lente sferica 9 o in miniatura assemblee lenti dell&#39;obiettivo 10-11 può essere impiegato. L&#39;alta risoluzione microendoscope qui descritto essenzialmente funziona come un grande campo epi-microscopio a fluorescenza, quindi non sezionamento ottico (come in microscopia confocale o non lineare) deve essere previsto. Nella nostra esperienza, usando luce di eccitazione 455 nm e proflavina attualità come agente di contrasto, la luce è in primo luogo raccolto da una profondità corrispondente ad un paio di strati di cellule. Questo protocollo deve permettere al lettore di assemblaggio ad alta risoluzione microendoscope sul bancone, con un ingombro compatto di 10 &quot;x 8&quot;. Se lo si desidera, il sistema può essere racchiuso in una scatola ed i componenti elettrici (LED e telecamera) alimentato da un pacco batteria (Figura 1d). Molte fotocamere compatte può essere alimentato da IEEE-1394 (Firewire) e le porte USB del computer host.

<table><tbody><tr><td>Camera CCD</td><td>Point Grey Research</td><td>GRAS-14S5M</td><td></td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>M455L2</td><td>Selezionato per l'uso con proflavina &amp;#8211; altri fluorofori potrebbero richiedere componenti diversi</td></tr><tr><td>Filtro di eccitazione</td><td>Semrock</td><td>452/45</td><td>Selezionato per l'uso con proflavina &amp;#8211; altri fluorofori potrebbero richiedere componenti diversi</td></tr><tr><td>Filtro di emissione</td><td>Semrock</td><td>550/88</td><td>Selezionato per l'uso con proflavina &amp;#8211; altri fluorofori potrebbero richiedere componenti diversi</td></tr><tr><td>Specchio dicromatico</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>485 DCLP</td><td>Selezionato per l'uso con proflavina &amp;#8211; altri fluorofori potrebbero richiedere componenti diversi</td></tr><tr><td>Lente obiettivo</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>RMS 10X</td><td></td></tr><tr><td>Lente tubo</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AC-254-150-A1</td><td>Selezionare la lunghezza focale per ottenere l'ingrandimento richiesto al CCD</td></tr><tr><td>Lente condensatore</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>ACL2520</td><td></td></tr><tr><td>Unità cubo a gabbia</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2</td><td></td></tr><tr><td>Barre e piastre della gabbia</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3)</td><td></td></tr><tr><td>Unità specchio piegato</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>KCB1, PF10-03-G01</td><td></td></tr><tr><td>Tubi per lenti</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1L05, SM1L30, SM1V05 (o SM1Z)</td><td></td></tr><tr><td>Adattatori / giunti</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2)</td><td></td></tr><tr><td>Connettori SMA</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>SM1SMA, 11040A</td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore LED</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>LEDD1B TPS001</td><td></td></tr><tr><td>Fascio di fibre ottiche</td><td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td><td>IGN-08/30</td><td>Sono disponibili fasci di dimensioni maggiori o minori (Sumitomo / Fujikura)</td></tr></tbody></table>

ad alta risoluzione in fibra ottica per microendoscopy in situ cellular imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Molti studi biologici e clinici richiedono lo studio longitudinale e l&#39;analisi della morfologia e funzione con risoluzione a livello cellulare. Tradizionalmente, gli esperimenti multipli sono in parallelo, con singoli campioni rimosso dallo studio in momenti sequenziali per la valutazione al microscopio ottico. Intravitale diverse tecniche sono state sviluppate, con confocale, multiphoton, e secondo microscopia armonica tutti dimostrando la loro capacità di essere utilizzato per l&#39;imaging in situ 1. Con questi sistemi, tuttavia, la cosa è tecnicamente complessa e costosa, che coinvolgono i sistemi di scansione laser e complessi sorgenti luminose. Qui vi presentiamo un protocollo per la progettazione e l&#39;assemblaggio di una ad alta risoluzione microendoscope che può essere costruita in un giorno con off-the-shelf componenti per meno di US $ 5.000. La piattaforma offre flessibilità in termini di risoluzione, campo di vista, e la lunghezza d&#39;onda di funzionamento, e viene descritto come questi parametri possono essere facilmente modificato per soddisfare le esigenze specifiche dell&#39;utente finale. Noi e gli altri hanno esplorato l&#39;utilizzo del microendoscope ad alta risoluzione (HRME) in coltura cellulare in vitro 2-5, in 6 asportato e tessuti animali che vivono 2,5, e nei tessuti umani in vivo 2,7. Gli utenti hanno segnalato l&#39;uso di diversi agenti di contrasto fluorescente, tra cui proflavina 2-4, benzoporfirina derivate anello monoacid A (BPD-MA) 5, e fluoroscein 6,7, che hanno ricevuto pieno, o l&#39;approvazione sperimentale da parte della FDA per l&#39;uso in soggetti umani. Ad alta risoluzione microendoscopy, nella forma descritta qui, può fare appello ad una vasta gamma di ricercatori che lavorano nel campo delle scienze di base e clinica. La tecnica offre un approccio efficace ed economica che integra microscopia tradizionali da banco, permettendo all&#39;utente di eseguire ad alta risoluzione, immagini longitudinale in situ.

In molte situazioni biologici e clinici è vantaggioso per lo studio dei processi cellulari, come si evolvono nel loro microambiente nativo. Qui si descrive il montaggio e l&#39;uso di un basso costo in fibra ottica microscopio in grado di fornire immagini in tempo reale in coltura cellulare, studi su animali e studi clinici del paziente.

Ad alta risoluzione in fibra ottica per Microendoscopy In situ Cellular Imaging

Molti studi biologici e clinici richiedono l'analisi e lo studio longitudinale della morfologia e della funzione con una risoluzione a livello cellulare.

Tradizionalmente, gli studi biologici e clinici che richiedono un'analisi microscopica con risoluzione a livello cellulare sono stati condotti eseguendo più esperimenti in parallelo, rimuovendo campioni singoli dallo studio in punti temporali sequenziali per la valutazione mediante microscopia ottica, mentre la microscopia confocale, a due fotoni e armonica seconda sono tutte tecniche utili per l'imaging in situ. L'infrastruttura richiesta è complessa e costosa, in quanto prevede sistemi laser a scansione e sorgenti luminose complesse. Qui dimostriamo come costruire in un solo giorno un sistema di microendoscopia a fibra ottica ad alta risoluzione, utilizzando componenti disponibili sul mercato per meno di 5.000 dollari USA.La piattaforma offre flessibilità in termini di risoluzione dell'immagine, campo visivo e lunghezza d'onda operativa. Innanzitutto, viene assemblata una semplice struttura per microscopio a fluorescenza in epifluorescenza per ospitare una sorgente luminosa, filtri ottici, lenti, un fascio di fibre ottiche e una telecamera CCD. Successivamente, vengono installate le lenti di imaging, che formano un'immagine ingrandita del fascio di fibre ottiche sulla telecamera CCD.Una sorgente a LED viene quindi installata con ottiche di illuminazione al fine di fornire luce di eccitazione fluorescente al campione. Infine, utilizzando il microendoscopio assemblato, l'acquisizione di immagini in tempo reale rivela dettagli a livello cellulare di campioni marcati con fluorescenza, inclusi colture in vitro, modelli animali in vivo e soggetti umani. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia confocale o la microscopia a due fotoni è che è sufficientemente semplice ed economica, consentendo ai ricercatori che operano in una vasta gamma di settori di implementarla rapidamente e di personalizzarla in base alle proprie esigenze specifiche.L'endoscopio microscopico ad alta risoluzione descritto qui dovrebbe essere considerato come una configurazione di base, con diverse possibili varianti nell'assemblaggio e nell'applicazione. Nella selezione dei componenti per un'applicazione specifica, si devono considerare le relazioni intrinseche coinvolte nella microscopia a fluorescenza tra concentrazione del fluorocromo, fotodegradazione, intensità dell'illuminazione, sensibilità della telecamera, guadagno e tempo di esposizione. Questa piattaforma è progettata per essere utilizzata con la pro flavina come agente di contrasto fluorescente, ma può essere configurata per funzionare con altri coloranti fluorescenti.Pro flavin è un colorante nucleare brillante con lunghezze d'onda di assorbimento e di emissione massime rispettivamente di 445 nanometri e 515 nanometri. L'uso di altri agenti di contrasto richiederà all'utente di selezionare opportunamente i filtri di eccitazione, di emissione e dicromatici per assemblare il sistema di microendoscopio; iniziare collegando due aste per gabbia da sei pollici a due aste per gabbia da 1,5 pollici per formare una coppia di aste lunghe 7,5 pollici. Avvitare le aste su una faccia dell'unità con specchio piegato, quindi installare uno specchio con diametro di un pollice.Successivamente, avvitare quattro aste da 0,5 pollici sulla faccia opposta dell'unità dello specchio piegato. Inserire il cubo per gabbia nelle aste per gabbia da 7,5 pollici attraverso i due fori inferiori passanti. Avvitare le aste da due pollici sulla faccia laterale del cubo per gabbia.Utilizzando un adattatore da attacco C a SM1, collegare la telecamera a una piastra per sistema a gabbia. Fissare la piastra del sistema a gabbia sulle aste da 0,5 pollici in modo che sia allineata con la superficie anteriore dell'unità dello specchio piegatore. Selezionare una lente tubo con diametro di un pollice per formare un'immagine del fascio di fibre ottiche sulla telecamera.La lunghezza focale della lente deve essere selezionata in modo che la causa del fascio di fibre ottiche venga campionata da almeno due pixel. Quando si proietta l'immagine sulla fotocamera, inserire la lente in un tubo obiettivo lungo tre pollici e fissare la lente con un anello di ritenzione. Una chiave a forchetta è utile per avvitare gli anelli di ritenzione nei tubi obiettivo lunghi.Lasciare cadere il filtro di emissione nel tubo della lente da tre pollici, posizionandolo sopra il primo anello di ritenzione, e aggiungere un altro anello per fissare saldamente il filtro. Assicurarsi che l'orientamento del filtro rispetti la convenzione indicata dal produttore. Avvitare il tubo della lente sul lato del cubo della gabbia più vicino alla telecamera CCD.Questa posizione è mostrata anche qui. Si noti che nel diagramma, questa lente e questo filtro sono rappresentati senza il tubo per lente da tre pollici. Per chiarezza, collegare la fotocamera a un computer e visualizzare l'immagine sullo schermo.Orientare l'insieme della gabbia verso un oggetto distante e far scorrere il cubo della gabbia lungo le rotaie finché non appare a fuoco un'immagine dell'oggetto. Utilizzare un cacciavite per serrare le quattro viti situate sui lati del cubo della gabbia. Queste viti, quando serrate, afferrano le rotaie mantenendo il cubo in posizione.Questo garantirà che le lenti del tubo formino un'immagine focalizzata del fascio di fibre sulla fotocamera quando combinate con l'obiettivo corretto all'infinito. Successivamente, inserire lo specchio dicotomico nel supporto e posizionarlo a 45 gradi nel cubo della gabbia. Avvitare l'obiettivo tramite un adattatore filettato da RMS a SM e un tubo per lenti regolabile sulla faccia del cubo della gabbia opposta al supporto della lente del tubo.Successivamente, avvitare un connettore SMA su una piastra della gabbia e montarla sulle aste approssimativamente alla distanza di lavoro della lente dell'obiettivo. Aggiungere la piastra di base e il tappo terminale ai lati aperti del cubo della gabbia. Quindi montare un LED su una piastra della gabbia e farlo scorrere all'estremità delle aste da due pollici.Aggiungere una lente a un tubo porta-lente da 0,5 pollici in modo che, quando questo tubo viene avvitato lateralmente al cubo della gabbia, formi un'immagine del LED che riempia l'apertura posteriore dell'obiettivo. Inoltre, aggiungere il filtro di eccitazione al tubo porta-lente. A questo stadio, un alimentatore per LED può essere utilizzato per controllare l'intensità della luce di illuminazione mediante resina epossidica.Collegare un connettore SMA per una fibra da 1030 micron al fascio di fibre ottiche con campo visivo da 720 micron. Per informazioni dettagliate sulla connessione delle fibre ottiche, consultare T Thor labs, numero di parte FN nine six. Una guida alla connessione e alla lucidatura delle fibre ottiche.Avvitare il fascio di connettori SMA a occhiello nel connettore SMA montato sulle aste della gabbia. Indirizzare l'estremit&agrave; distale del fascio verso una sorgente luminosa a banda larga; &egrave; sufficiente una luce fluorescente. Successivamente, osservare l'immagine della faccia prossimale del fascio sulla telecamera CCD. Infine, regolare la posizione dell'obiettivo avvitandolo dentro o fuori dal cubo della gabbia.Finché l'immagine del fascio di fibre non appare a fuoco, la singola causa dovrebbe essere chiaramente visibile. La risoluzione spaziale del microendoscopio può essere aumentata aggiungendo una microottica o un insieme di lenti alla punta distale del fascio di fibre. Queste ottiche sono configurate in modo tale che, invece di appoggiare direttamente la punta del fascio sul tessuto, la punta viene proiettata sulla superficie del tessuto con una riduzione dem.In tal modo si aumenta la frequenza di campionamento spaziale imposta dalla guida della luce dovuta al fascio di fibre. Il grado di riduzione dell'ingrandimento corrisponde all'aumento della risoluzione spaziale e, allo stesso tempo, a una corrispondente diminuzione del campo visivo. Selezionare una lente GRIN con l'ingrandimento e la distanza di lavoro desiderati per la propria applicazione.Assicurarsi che il diametro della lente corrisponda a quello del fascio di fibre con cui si intende lavorare. Montare il fascio di fibre e la lente grin su basette di posizionamento manuale a tre assi separate, sotto un microscopio a basso ingrandimento o uno stereomicroscopio, per un allineamento accurato.Successivamente, applicare una goccia di adesivo ottico sulla lente o sulla faccia del fascio. Utilizzando i posizionatori manuali, portare le due componenti a contatto. Esporre l'interfaccia alla luce UV per il tempo raccomandato dal produttore per polimerizzare l'adesivo.Per proteggere l'obiettivo grin e l'interfaccia incollata, utilizzare un breve tratto di tubo capillare in alluminio per racchiudere il giunto. Far scorrere il tubo sul giunto e fissarlo in posizione con una goccia di resina epossidica a ciascuna estremità del tubo; utilizzare un tubo termorestringente per completare l'assemblaggio. Prima dell'imaging micro-endoscopico, applicare l'agente di contrasto sulle cellule o sul tessuto da immaginiare al fine di visualizzare le cellule e la coltura.Prima, rimuovere il mezzo di crescita mediante pipettaggio. Quindi aggiungere la soluzione di pro flavina pipettando delicatamente nel pozzetto. Dopo un'incubazione breve di un minuto al massimo, rimuovere la soluzione di pro flavina mediante pipettaggio e scartarla.Lavare le cellule aggiungendo e rimuovendo una soluzione fresca di PBS nel pozzetto. Montare l'estremità distale del fascio di fibre in un supporto stabile dotato di regolazioni manuali lungo gli assi x, Y, Z per garantire stabilità. Durante l'acquisizione dell'immagine, dopo l'applicazione del colorante alle cellule o al tessuto, posizionare il fascio di fibre ottiche a leggero contatto con il campione. Visualizzare l'immagine del fascio di fibre ottiche sullo schermo del computer, utilizzando il software fornito dal produttore della telecamera o qualsiasi software personalizzato che si desideri sviluppare.Regolare il tempo di esposizione e le impostazioni del guadagno della fotocamera per ottenere un'immagine di luminosità accettabile. Se assemblato correttamente, il microendoscopio funzionerà come un microscopio a fluorescenza in epilluminazione, trasmesso attraverso un fascio coerente di fibre ottiche. Per ottenere risultati ottimali nell'acquisizione delle immagini, è necessario prestare attenzione a garantire il rispetto di tre condizioni fondamentali.Prima di tutto, la faccia prossimale del fascio di fibre deve essere focalizzata sulla camera CCD senza sfocatura, al fine di ottenere la massima risoluzione del sistema. Qui viene mostrata una porzione di un fascio di fibre immaginata con scarsa messa a fuoco, leggera messa a fuoco e buona messa a fuoco. La messa a fuoco ottimale si ottiene regolando la posizione effettiva dell'obiettivo rispetto alla faccia del fascio.In secondo luogo, la faccia prossimale del fascio di fibre deve essere illuminata in modo uniforme su tutto il suo diametro. Come descritto in precedenza, ciò si ottiene configurando l'ottica di illuminazione per un'illuminazione colimata. L'immagine mostrata qui è stata acquisita quando un campione fluorescente uniforme viene illuminato in questa configurazione preferita.Il risultato corrispondente in condizioni di illuminazione critica è mostrato qui. La struttura del LED viene proiettata sulla faccia del fascio di fibre, causando l'apparizione di questo schema indesiderato sovrapposto alla vera struttura del campione. In terzo luogo, è importante assicurarsi che entrambe le facce, prossimale e distale, del fascio di fibre siano pulite e prive di graffi e scheggiature.In questo esempio, dei detriti sono attaccati alla superficie del fascio e un danno sotto forma di una piccola scheggiatura alle cinque è visibile sul perimetro della fibra. I detriti possono essere rimossi dalle superfici del fascio pulendo allo stesso modo dei connettori ottici convenzionali, utilizzando carta per lenti e isopropanolo oppure strumenti standard per la pulizia delle fibre ottiche. 1483 cellule sono state marcate con pro flavina e il fascio di fibre nudo è stato appoggiato leggermente sul campione.L'imaging in vitro è mostrato qui quando una lente grin di 2,5 x è stata fissata alla punta del fascio, ottenendo un miglioramento della risoluzione spaziale e una riduzione del campo visivo. L'imaging in vivo, in cui un fascio di fibre con un diametro esterno di 0,5 millimetri è stato inserito attraverso un ago da 21 gauge ed avanzato nel tessuto del pad adiposo mammario di un topo, è stato eseguito come mostrato in questo filmato, in cui gli adipociti sono chiaramente visibili con movimento dovuto al ciclo cardiaco. In questo esempio, l'imaging della mucosa orale in un volontario umano sano è stato effettuato utilizzando un fascio di fibre più grande con un diametro esterno di 1,5 millimetri.In tutti gli esempi, è stato utilizzato il pro flavina come agente di contrasto fluorescente per l'etichettatura nucleare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come progettare e assemblare un microendoscopio a fibra ottica per l'imaging fluorescente in C due di cellule e tessuti.

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