Name: Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Impara a isolare e coltivare cellule endoteliali polmonari da topi neonati utilizzando digestione enzimatica e microsfere magnetiche con anticorpi anti-PECAM-1 e anti-ICAM-2. Questo metodo garantisce alte purezza e resa cellulare.

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Questa ricerca è stata sostenuta in parte dalla American Heart Association concedere 0950118G.to MC-W.

1. Preparazione biglie magnetiche anti-PECAM-1 anticorpo-coniugato (Dynabeads) <ol><li> Preparare 0,1% BSA in PBS mescolando 50 mg in 50 ml di BSA PBS usando un vortice fino a BSA si dissolve. Sterilizzare per filtrazione attraverso filtro 0,22 micron siringa. Conservare a 4 ° C. </li><li> Nel cofano TC, trasferire 200 ul di ben risospeso pecora anti-topo IgG Dynabeads in una provetta Eppendorf da 1,5 ml e lavare le perle: il tubo di Monte MPC e lasciate riposare per circa 1 minuto per consentire le perle di sedimento. Aspirare il surnatante, rimuovere il tubo dal MPC e risospendere le sfere in 1 ml di sterile 0,1% BSA / PBS. Pipetta su e giù per risospendere le sfere. </li><li> Ripetere il lavaggio altre tre volte, per un totale di quattro lavaggi. </li><li> Rimuovere la provetta dal MPC e risospendere le sfere in 500 ml di 0,1% BSA / PBS. </li><li> Aggiungere 10 microlitri di ratto anti-topo PECAM-1 (CD-31) anticorpi al tubo. </li><li> Caduta durante la notte a 4 ° C nella stanza fredda o 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le perline con sterile 0,1% BSA / PBS come descritto al punto 1,2 quattro volte. </li><li> Rimuovere la provetta dal MPC e risospendere le sfere in 200 l 0,1% BSA / PBS. Conservare anti-PECAM-1 anticorpo-coniugato Dynabeads a 4 ° C per un massimo di 1 mese. </li></ol> 2. Isolare topo le cellule endoteliali polmonari di topi neonati Prima di procedere con il protocollo di purificazione del tessuto, IACUC approvazione del Comitato delle procedura è necessaria. <ol><li> Preparare la seguente: <ul><li> 15 ml di 1 mg / ml C / D soluzione in DMEM. Filtro con siringa da 0,22 micron filtro e calda a 37 ° C. </li><li> Tubo da 50 ml con 15 ml di DMEM, memorizzare sul ghiaccio </li><li> Isolamento Media (IM) contenente 20% FBS e 1 penicillina / streptomicina in DMEM </li><li> 2% di gelatina. Mix 2 g di pelle bovina gelatina con 100 ml di acqua gg, autoclave 15 minuti e conservare a 4 ° C. Calda a 37 ° C per liquefare prima del rivestimento fiaschi TC. </li></ul></li><li> Anestetizzare tre cuccioli di 6-8 giorno di vita con una iniezione IP di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Controllare l'efficacia di anestesia e sezionare gli animali uno per uno, come segue: cuccioli Pin a bordo, bagnare la pelle con il 70% etanolo e togliere la pelle dalla zona del torace con le forbici dissezione sterile. Accise la gabbia toracica per esporre polmoni. </li><li> Asetticamente accise lobi polmonari individuale, facendo attenzione a non sezionare i bronchi e visibile qualsiasi tessuto connettivo intorno ai polmoni. Unire tutti polmoni ghiacciata DMEM. Eutanasia dei cuccioli. </li><li> Lavorare nel cofano TC, rimuovere lobi polmonari da DMEM, posto in un piatto da mm 100 TC e aspirare l'eccesso DMEM. </li><li> Usando forbici sterili, tritare finemente il tessuto tagliando ~ 100 volte. Trasferimento a 15 ml caldo C / D soluzione per la digestione enzimatica. Incubare 45 minuti a 37 ° C su un rotatore. </li><li> Nel cofano TC, aspirare la sospensione tessuto digerito in una siringa da 20 ml con 14 g grumi cannula collegata e triturare in una sospensione singola cella, almeno 12 volte. </li><li> Passare la sospensione dei tessuti attraverso un filtro a 70 micron di cellule e lavare il filtro con 15 ml di IM per fermare la digestione. </li><li> Pellet sospensione cellulare mediante centrifugazione a 400x g per 5 minuti. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere pellet in 3 ml 0,1% BSA / PBS. </li><li> Trasferimento sospensione cellulare a 5 ml a fondo rotondo in polistirene e aggiungere 22,5 microlitri anti-PECAM-1 anticorpo-coniugato Dynabeads. Tumble a temperatura ambiente per 12 minuti. </li><li> Un cappotto T75 pallone con 2 ml al 2% di gelatina e aspirare l'eccesso di gelatina. Lasciare asciugare gelatina all'interno della cappa TC per circa 30 minuti prima di cellule placcatura. </li><li> Dopo l'incubazione tallone è completo (passo 2.10), divisi equamente sospensione cellulare in tre provette Eppendorf e montata sul MPC. </li><li> Quando le microsfere sono sedimentate con il MPC (~ 1 min), raccogliere il supernatante, rimuovere tubo da MPC, lavare perline con ~ 1 ml 0,1% BSA / PBS, e poi rimontare sul MPC. </li><li> Ripetere il lavaggio quattro volte (totale 5 lavaggi) </li><li> Perline Risospendere in 1 ml di VascuLife con EnGS-Mv Vita Fattori Kit e 1x penicillina / streptomicina (VL) per tubo, mescolando bene. </li><li> Piastra su un preverniciato T75 pallone e portare il volume totale in ogni pallone a 10 ml con VL. </li><li> Cambiare i media il giorno successivo, 1 giornata piena di crescita, e quindi modificare la metà dei mezzi di comunicazione a giorni alterni. Quando le cellule sono&gt; 70-80% confluenti o più (di solito dopo 3-4 giorni di cultura), possono essere ordinati con anti-ICAM-2 Dynabeads. </li></ol> 3. Preparazione anti-ICAM-2 anticorpo-coniugato Dynabeads <ol><li> Dynabeads anti-ICAM-2 anticorpo-coniugato vengono utilizzati per purificare ulteriormente le cellule che sono state selezionate con anti-PECAM-1 anticorpo-coniugato Dynabeads e colto fino confluenti. Questa procedura viene eseguita come descritto per Dynabeads anti-PECAM-1 anticorpo-coniugato (1, sopra), tranne che anti-topo ICAM-2 (CD-102) viene usato al posto degli anticorpi anti-PECAM-1 anticorpi. </li><li> Dynabeads anti-ICAM-2 anticorpo-coniugato può essere conservato a 4 ° C per un massimoa 1 mese. </li></ol> 4. Ordinamento cellule polmonari endoteliali Mouse con anti-ICAM-2 Dynabeads <ol><li> Cappotto T75 cultura fiasco del tessuto con il 2% di gelatina. </li><li> Aspirare il supporto dal confluenti T75 pallone con le cellule e lavare con 8 ml di PBS. </li><li> Aspirare il PBS, aggiungere 2 ml 0,05% tripsina / EDTA e lasciare che le cellule staccare (circa 5 minuti). Toccare fiaschi leggermente per aiutare distacco. </li><li> Quando le cellule sono staccati, aggiungere 2 ml IM di inibire le cellule tripsina e raschiare di staccare tutte le cellule rimanenti aderente. Trasferimento sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e spin down per 5 min a 400x g. </li><li> Aspirare i media e risospendere pellet di cellule in 2 ml 0,1% BSA / PBS. </li><li> Trasferire in un polistirolo da 5 ml a fondo rotondo tubo e aggiungere 10 microlitri anti-ICAM-2 Dynabeads. Biancheria per 12 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Split sospensione cellulare in due provette Eppendorf da 1,5 ml e montata sul MPC. </li><li> Aspirare il surnatante dopo perline hanno aderito per un minuto. Rimuovere i tubi da MPC e risospendere ogni tubo in 1 ml 0,1% BSA / PBS. Rimontare il MPC. </li><li> Ripetere il lavaggio quattro volte (totale di 5 lavaggi). </li><li> Risospendere ogni provetta contenente 1 ml VL ed eseguire un conteggio delle cellule. </li><li> Cellule piastra a 250-350K cellule per T25 pallone e / o 750K-1 milioni di cellule per T75 pallone. </li><li> Portare il volume a 5 VL ml in fiasche T25 e T75 in 10 ml fiaschi. </li><li> Cambiare i media a giorni alterni. Le celle possono essere utilizzati per esperimenti quando la cultura raggiunge circa l'80% confluenza, di solito in 2-3 giorni. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati In genere, dopo 6-7 giorni dalla preparazione iniziale delle cellule, siamo in grado di ottenere circa 1,2-1,5 x 10 6 cellule endoteliali polmonari da tre 6-8 cuccioli giorno di vita. Cellule visualizzazione tipica morfologia "ciottoli" al microscopio ottico e mostrare VE-caderina (CD144) colorazione a giunzioni cellula-cellula, che è caratteristico per le cellule endoteliali (Figura 1). Maggioranza di esprimere MLECs VE-caderina e VEGFR2 come dimostrato da analisi FACS (Figura 2). Di solito, li usiamo per esperimenti entro due settimane dopo l'isolamento iniziale MLEC. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Analisi al microscopio di confluenti monostrato MLEC. (A) immagine microscopia evidenzia morfologia ciottoli di cellule in coltura tipica per le cellule endoteliali. Uniforme strutture rotondo situato nella zona perinucleare di molte cellule sono le sfere magnetiche utilizzate per l'isolamento MLEC. (B) endoteliali specifici VE-caderina è localizzato presso la cellula-cellula incroci, come indicato usando la microscopia confocale. Bar è rappresentativo di 20μm. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 analisi FACS di MLECs colto etichettati con anticorpi specifici per l'endotelio-specifici marcatori:. VE-caderina (CD144) o VEGFR2, come accusato, seguita da ficoeritrina anticorpo secondario coniugato, conferma l'identità di MLECs endoteliali isolate. Linea rossa indica isotipo-specifici di controllo, la linea verde indica anti-VE-caderina o anti-VEGFR2 - specifica-IgG.

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</ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal Medical College of Wisconsin IACUC Comitato ai sensi del protocollo AUA # 00001206.

Microvascolari EC hanno dimostrato di essere un modello utile in molte aree della biologia vascolare e si crede di essere più fisiologicamente rilevanti per lo studio (angiogenesi ad esempio) che ampiamente studiato HUVECs 3. In precedenza, è stato riportato che microvascolare EC possono essere ottenute da reni, cuore, tessuto adiposo della pelle, della retina, del cervello, i gliomi, ma anche polmone 2, 4-7, 10, 11. Tuttavia, un metodo coerente e affidabile per l&#39;isolamento di microvascolare ECS è ancora necessaria. La procedura qui presentata è una modifica di un protocollo precedentemente pubblicato 2; si differenzia dalla maggior parte delle procedure pubblicate in quanto utilizza cuccioli invece di animali adulti. Questo è fondamentale per il successo isolamento di cellule da giovani animali hanno un potenziale di proliferazione maggiore e culture deriva dal loro tessuti tendono a produrre un numero maggiore di cellule. Una settimana di vita gli animali sembrano essere ottimali, ma più giovani topi (giorno-vecchio 4) può anche essere usato. Inoltre, i numeri più alti o più bassi di cuccioli può essere utilizzata, se necessario, in quanto siamo riusciti a isolare MLECs da un cucciolo. Tuttavia, mentre la scala verso l&#39;alto o verso il basso il processo di isolamento, placcatura densità cellulare deve rimanere invariato, in quanto questo è anche fondamentale per la proliferazione cellulare. Il 2-step del processo di purificazione MLECs utilizzando biglie magnetiche coniugate prima anti-PECAM-1 e di anti-ICAM-2 anticorpi è molto più efficiente ad ottenere puro culture CE rispetto alla precedentemente descritte passo-passo le procedure di purificazione. Questo protocollo elimina la necessità di utilizzare tecniche manuali molto laborioso, centrifugazione gradiente e FACS meno efficiente di smistamento per le cellule scartando contaminanti, come i fibroblasti, cellule del sangue e cellule muscolari lisce. La popolazione risultante MLEC può essere utilizzato per l&#39;analisi in vitro delle risposte angiogenici, permeabilità vascolare e la trasmigrazione dei leucociti, la guarigione della ferita e l&#39;analisi biochimica delle vie di segnalazione. Se necessario, MLECs può essere placcato su superfici diverse, come coprioggetto fibronectina o gelatina rivestite di immunofluorescenza o array di elettrodi per la trans-endoteliale resistenza (TER) misurazioni. Risultati ottenuti possono essere direttamente confrontati con i fenotipi osservate in vivo, che è particolarmente importante nel contesto del crescente numero di eliminazione diretta e le linee di topi transgenici. Il successo di questo metodo per l&#39;analisi in vitro dei meccanismi cellulari alla base difetti osservate in vivo, è già stato presentato 12.

<table><tbody><tr><td>Forbici a molla</td><td>Fine Science Tools</td><td>15032-13</td><td></td></tr><tr><td>pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>cannula 14G</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482516N</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 20 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>microsferette Dynabeads anti-IgG di ratto</td><td>Invitrogen</td><td>110.35</td><td></td></tr><tr><td>concentratore di particelle magnetiche (MPC)</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-PECAM-1 murino (CD-31)</td><td>BD Biosciences</td><td>553369</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-ICAM-2 murino (CD-102)</td><td>BD Biosciences</td><td>553326</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi/Dispasi (C/D)</td><td>Roche Group</td><td>11097113001</td><td>può essere preparata una soluzione madre da 100 mg/ml e conservata a -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina di pelle bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G9391-100G</td><td></td></tr><tr><td>kit completo Vasculife EnGS-Mv (VL)</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL0004</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA 0,05%</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>filtrino cellulare in nylon da 70 &amp;mu;m</td><td>Falcon BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>flacone per colture cellulari da 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90076</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Le cellule endoteliali forniscono un utile modello di ricerca in molte aree della biologia vascolare. Fin dal suo primo isolamento 1, cellule endoteliali della vena ombelicale (HUVECs) hanno dimostrato di essere comodo, facile da ottenere e cultura e, quindi, sono le cellule più ampiamente studiato endoteliali. Tuttavia, per la ricerca si è focalizzata sui processi come gli altri angiogenesi, permeabilità o molti, cellule endoteliali (EC) sono un modello molto più fisiologicamente rilevanti per lo studio 2. Inoltre, EC isolate da topi knockout per fornire un utile strumento per l&#39;analisi ex-vivo di funzione della proteina. Diversi approcci per isolare e microvascolare cultura EC di diversa provenienza sono stati segnalati fino ad oggi 3-7, ma consistente isolamento e la cultura della pura ECS è ancora un grave problema tecnico in molti laboratori. Qui, forniamo un passo-passo protocollo su un metodo affidabile e relativamente semplice di isolare e coltura delle cellule endoteliali del polmone del mouse (MLECs). In questo approccio, tessuto polmonare ottenuti da 6 - a 8 giorni di cuccioli di età è prima tagliato a pezzi, digerito con collagenasi / dispasi (C / D) la soluzione e disperse meccanicamente in cella singola sospensione. MLECS sono purificati dalla sospensione cellulare tramite selezione positiva con l&#39;anti-PECAM-1 coniugato a Dynabeads utilizzando un concentratore di particelle magnetiche (MPC). Tali cellule purificate sono coltivati ​​su gelatina rivestita coltura tissutale (TC) piatti fino a diventare confluenti. A quel punto, le cellule sono ulteriormente purificato con Dynabeads accoppiato ad anti-ICAM-2 anticorpi. MLECs ottenuti con questo protocollo mostra un fenotipo ciottoli, come visualizzato in contrasto di fase microscopia ottica, e il loro fenotipo endoteliale è stata confermata con analisi FACS con anti-VE-caderina 8 e anti-VEGFR2 9 anticorpi e colorazione di immunofluorescenza di VE-caderina. Nelle nostre mani, questa procedura in due fasi isolamento in modo coerente e affidabile produce una popolazione pura di MLECs, che può essere ulteriormente coltivate. Questo metodo permetterà ai ricercatori di sfruttare il crescente numero di topi transgenici e knockout per correlare direttamente studi in vivo con i risultati di esperimenti in vitro eseguiti su MLECs isolato, contribuendo così a svelare i meccanismi molecolari del fenotipo vascolare osservata in vivo.

Qui, descriviamo un protocollo per l&#39;isolamento e la coltura di cellule murine endoteliali polmonari. Questo metodo comprende meccanico e dissociazione enzimatica tessuto polmonare e una 2-step processo di purificazione con anti-PECAM-1 e anti-ICAM-2 anticorpi coniugati a sfere magnetiche, che produce una popolazione pura di cellule endoteliali di origine per lo più microvascolare.

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Le cellule endoteliali rappresentano un utile modello di ricerca in molti ambiti della biologia vascolare. Sin dal loro primo isolamento 1, le cellule endoteliali della vena ombelicale umana ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e coltivare cellule endoteliali polmonari da topi neonati. Questo viene ottenuto innanzitutto creando una sospensione cellulare omogenea a partire da polmoni appena isolati. Infine, il tessuto viene tritato finemente e sottoposto a digestione enzimatica, quindi arricchito per le cellule endoteliali mediante microsferette magnetiche coniugate con anticorpi anti P chem one.La coltura CETA purifica la popolazione di cellule endoteliali. Successivamente, utilizzando microsferette magnetiche coniugate con un anticorpo anti I chem due e amplificando queste cellule in un matraccio rivestito di gelatina. Le cellule endoteliali polmonari primarie risultanti sono prevalentemente di origine microvascolare ed esprimono marcatori specifici delle cellule endoteliali come TERRIN e VEGF R due.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il silenziamento genico tramite irna, è che consente l'utilizzo di topi transgenici per ottenere cellule endoteliali geneticamente modificate. Inoltre, le cellule endoteliali ottenute con questa tecnica sono prevalentemente di origine microvascolare e, come tali, possono risultare più pertinenti per alcune aree della ricerca vascolare. Le cellule endoteliali ottenute mediante questo metodo possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia vascolare, come quelle relative ai meccanismi molecolari dell'angiogenesi e della permeabilità vascolare.La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale poiché i passaggi di digestione del tessuto prelevato e di lavaggio delle cellule legate alle perle sono difficili da apprendere. Un'esecuzione non corretta di questa tecnica può portare a contaminazione da cellule non endoteliali e a una scarsa resa e crescita cellulare. Per questo protocollo con dyna beads, preparare 50 millilitri di BSA 0,1% in PBS e mescolare mediante vortex fino a completa dissoluzione della BSA, quindi sterilizzare la soluzione facendola passare attraverso una siringa da 0,22 micron.Filtrare in condizioni sterili all'interno della cappa a flusso laminare per colture cellulari, risospendere le perle Dynabeads anti ratto IgG ovine e trasferire 200 microlitri in una provetta Eppendorf da 1,5 millilitro. Per lavare le perle, posizionare la provetta sul concentratore di particelle magnetiche (MPC) e lasciare sedimentare le perle per un minuto; quindi aspirare il sopranatante. Rimuovere la provetta dal MPC e risospendere le perle in un millilitro di PBS sterile contenente lo 0,1% di BSA.Ripetere questo lavaggio altre tre volte dopo il quarto lavaggio. Rimuovere il tubo dal MPC e dal Resus. Sospendere le perle in 500 microlitri di 0,1% B-S-A-P-B-S.Aggiungere 10 microlitri di anticorpo rat anti mouse pcam uno al tubo e agitare delicatamente per due ore a temperatura ambiente, come mostrato in precedenza. Lavare le perle quattro volte con B-S-A-P-B-S sterile allo 0,1%. Rimuovere il tubo dall'MPC e risospendere.Le perle in 200 microlitri di soluzione di BSA-PBS allo 0,1%. Questa preparazione di perle Dynabeads coniugate con l'anticorpo anti-P chem uno viene conservata a quattro gradi Celsius. Per ottenere cellule primarie, anestetizzare tre cuccioli di età compresa tra sei e otto giorni.Verificare l'efficacia dell'anestesia pizzicando la coda con una pinzetta. Dissezionare gli animali in sequenza. Prima fissare il cucciolo su un supporto e rimuovere la pelle dalla zona toracica.Con forbici da dissezione, asportare la gabbia toracica per esporre i polmoni. Ora asportare in modo asettico i singoli lobi polmonari, avendo cura di non dissezionare i bronchi o qualsiasi tessuto connettivo visibile intorno ai polmoni.Unire tutti i polmoni in DMEM freddo su ghiaccio e infine eutanasia i cuccioli. Passare ora alla cappa a flusso laminare. Rimuovere i lobi polmonari dal DMEM e posizionarli in una piastra di coltura tissutale da 100 millimetri.Aspirare l'eccesso di DMEM con forbici sterili e tritare il tessuto. Infine, effettuare circa cento tagli per la digestione enzimatica. Trasferire la preparazione del tessuto in 15 millilitri di soluzione calda di collaghenasi per lo spazio discale e incubare per 45 minuti a 37 gradi Celsius su un agitatore rotativo, utilizzando una siringa da 20 millilitri collegata a una cannula da 14 gauge, al fine di frammentare gli aggregati del tessuto digerito in una sospensione di singole cellule.Ora far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri e lavare il filtro con 15 millilitri di Im per arrestare la reazione di digestione. Per raccogliere le cellule polmonari, centrifugare a 400 G per cinque minuti ed aspirare il sopranatante. Successivamente, risospendere il pellet cellulare in tre millilitri di 0,1% B-S-A-P-B-S e trasferire in un tubo rotondo in polistirene da cinque millilitri.Per isolare le cellule endoteliali, aggiungere 22,5 microlitri di microsferette Dynabeads coniugate con anticorpo anti P chem uno e agitare a temperatura ambiente per 12 minuti. Nel frattempo, ricoprire una fiasca T75 con due millilitri di gelatina al 2%. Aspirare la soluzione di gelatina in eccesso e lasciare asciugare all'aria all'interno della cappa a flusso laminare per circa mezz'ora. Una volta completata l'incubazione con le microsferette, dividere in parti uguali la sospensione cellulare in tre provette Fender e montare sull'MPC.Utilizzando il sistema MPC, lavare le perle dyna per cinque volte con circa un millilitro di 0,1% B-S-A-P-B-S. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le perle in un millilitro di VAs life per tubo. Mescolare bene unendo tutti i tubi. Piastrare la preparazione cellulare con perle dyna sul flask T 75 pre-codificato e portare il volume totale nel flask a 10 millilitri con VAs life.Ora posizionare i flaconi in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Cambiare il mezzo il giorno successivo, consentire un giorno intero di crescita e quindi sostituire metà del mezzo ogni due giorni fino a quando le cellule non raggiungono una confluenza superiore al 70-80%. Per ulteriore purificazione della coltura cellulare primaria, preparare le dinabeads coniugate con anticorpo come mostrato in precedenza, ma questa volta utilizzando l'anticorpo CD102 e Muse I chem due.Rivestire anche un fiasco da coltura cellulare T 75 con gelatina al 2% come mostrato in precedenza. Ora rimuovere il fiasco T 75 con le cellule dall'incubatore. Aspirare il mezzo e lavare le cellule primarie con otto millilitri di PBS, quindi aspirare.Aggiungere due millilitri di tripsina-EDTA 0,05% in PBS e lasciare agire per circa cinque minuti affinché le cellule si stacchino. Toccare leggermente il flacone per favorire il distacco cellulare. Aggiungere due millilitri di mezzo di coltura (IM) per inibire la tripsina e raschiare eventuali cellule aderenti rimaste.Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione per cinque minuti a 400 ×g, aspirare il mezzo e risospendere il pellet cellulare in due millilitri di PBS con lo 0,1% di BSA. Trasferire in un tubo rotondo in polistirene da cinque millilitri e aggiungere 10 microlitri di anti-ICAM-2 Dynabeads. Incubare per 12 minuti a temperatura ambiente, suddividere la sospensione cellulare in due tubi Eppendorf da 1,5 millilitri e posizionarli sul sistema MPC.Come in precedenza, lavare le perle con un millilitro di BSA-PBS al 0,1% per un totale di cinque volte. Ora risospendere ciascun tubo in un millilitro di VAs life ed eseguire un conteggio cellulare. Infine, seminare le cellule a una densità di 800-1000 K cellule per fiasca T75 in 10 millilitri di VAs life. Posizionare le fiasche in un incubatore per colture cellulari.Cambiare il mezzo ogni due giorni fino a quando le colture raggiungono una confluenza di circa l'80%. Le cellule endoteliali polmonari di topo purificate sono pronte per essere utilizzate negli esperimenti. Tipicamente, una preparazione cellulare ottenuta da tre topi di età compresa tra sei e otto giorni fornisce da 1,2 a 1,5 × 10⁶ cellule endoteliali polmonari dopo una settimana in coltura.Come previsto, queste cellule endoteliali primarie mostrano una morfologia a selciato in microscopia ottica e presentano anche una colorazione coerente per VE alle giunzioni intercellulari. Utilizzando questo protocollo, la maggior parte delle cellule endoteliali polmonari del topo esprime VE coerente e VEGF R due, come dimostrato dall'analisi mediante fax. La linea rossa indica il controllo specifico per isotipo, mentre la linea verde indica l'IgG specifica anti-VE o anti-VEGF R due.Quando si esegue questa procedura, è importante raccogliere solo il tessuto bersaglio, evitare un'eccessiva digestione delle cellule e lavare accuratamente le cellule legate alle microsferette. Le cellule endoteliali ottenute utilizzando questo metodo possono essere impiegate in saggi funzionali nel campo della biologia vascolare per analizzare risposte rilevanti per l'angiogenesi e la permeabilità vascolare.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare cellule endoteliali primarie da mouse utilizzando l'anticorpo chem one e l'anticorpo chem two legati ai dyna beeps, e di come ottenere colture pure di cellule endoteliali.

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