Name: Preparazione di acuta fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche durante linvecchiamento e Amiloide Patologia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 57 s
Description: Impara a preparare fette acute di ippocampo da ratti e topi anziani per studiare le alterazioni sinaptiche legate all'invecchiamento e alla patologia amiloide. Questo protocollo minimizza i danni durante la dissezione.

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Lavoro sostenuto da NIH concedere AG027297, un premio dal Kentucky Spinal Cord Injury e fiducia capo della ricerca, e un dono da parte della Fondazione Kleberg.

<ol><li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+balance+of+protein+kinase%2Fphosphatase+activities+parallel+reduced+synaptic+strength+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Alterations in the balance of protein kinase/phosphatase activities parallel reduced synaptic strength during aging.</a> J Neurophysiol. 80, 1567-1570 (1998).</li>
<li>Norris, C. M., Korol, D. L., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+susceptibility+to+induction+of+long-term+depression+and+long-term+potentiation+reversal+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased susceptibility to induction of long-term depression and long-term potentiation reversal during aging.</a> J Neurosci. 16, 5382-5392 (1996).</li>
<li>Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+%27zipper%27+slice+studies+reveal+a+necessary+role+for+calcineurin+in+the+increased+activity+of+L-type+Ca%282%2B%29+channels+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Hippocampal 'zipper' slice studies reveal a necessary role for calcineurin in the increased activity of L-type Ca(2+) channels with aging.</a> Neurobiol Aging. 31, 328-338 (2010).</li>
<li>Burke, S. N., Barnes, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+synapses+and+hippocampal+circuit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Senescent synapses and hippocampal circuit dynamics.</a> Trends Neurosci. 33, 153-161 (2010).</li>
<li>Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+homeostasis+and+modulation+of+synaptic+plasticity+in+the+aged+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium homeostasis and modulation of synaptic plasticity in the aged brain.</a> Aging Cell. 6, 319-325 (2007).</li>
<li>Foster, T. C., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+changes+in+Ca%282%2B%29-dependent+processes%3A+relation+to+hippocampal+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Age-associated changes in Ca(2+)-dependent processes: relation to hippocampal synaptic plasticity.</a> Hippocampus. 7, 602-612 (1997).</li>
<li>Thibault, O., Gant, J. C., Landfield, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+calcium+hypothesis+of+brain+aging+and+Alzheimer%27s+disease%3A+minding+the+store%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Expansion of the calcium hypothesis of brain aging and Alzheimer's disease: minding the store.</a> Aging Cell. 6, 307-317 (2007).</li>
<li>Demuro, A., Parker, I., Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+and+amyloid+toxicity+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling and amyloid toxicity in Alzheimer disease.</a> J Biol Chem. 285, 12463-12468 (2010).</li>
<li>Green, K. N., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+calcium+to+Abeta+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Linking calcium to Abeta and Alzheimer's disease.</a> Neuron. 59, 190-194 (2008).</li>
<li>Kumar, A., Thinschmidt, J. S., Foster, T. C., King, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+effects+on+the+limits+and+stability+of+long-term+synaptic+potentiation+and+depression+in+rat+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Aging effects on the limits and stability of long-term synaptic potentiation and depression in rat hippocampal area CA1.</a> J Neurophysiol. 98, 594-601 (2007).</li>
<li>Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+age-related+alterations+in+synaptic+plasticity+by+blockade+of+L-type+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversal of age-related alterations in synaptic plasticity by blockade of L-type Ca2+ channels.</a> J Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).</li>
<li>Norris, C. M., Scheff, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+afferent+function+and+synaptic+strength+in+hippocampal+CA1+following+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Recovery of afferent function and synaptic strength in hippocampal CA1 following traumatic brain injury.</a> J Neurotrauma. 26, 2269-2278 (2009).</li>
<li>Sama, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-dependent+signaling+between+astrocytes+and+neurons+depends+critically+on+astrocytic+calcineurin%2FNFAT+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-dependent signaling between astrocytes and neurons depends critically on astrocytic calcineurin/NFAT activity.</a> J Biol Chem. 283, 21953-21964 (2008).</li>
<li>Ye, H., Jalini, S., Mylvaganam, S., Carlen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+large-conductance+Ca%282%2B%29-activated+K%28%2B%29+channels+depresses+basal+synaptic+transmission+in+the+hippocampal+CA1+area+in+APP+%28swe%2Find%29+TgCRND8+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Activation of large-conductance Ca(2+)-activated K(+) channels depresses basal synaptic transmission in the hippocampal CA1 area in APP (swe/ind) TgCRND8 mice.</a> Neurobiol Aging. 31, 591-604 (2010).</li>
<li>Bear, M. F., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity%3A+LTP+and+LTD%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity: LTP and LTD.</a> Curr Opin Neurobiol. 4, 389-399 (1994).</li>
<li>Foster, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+hippocampal+synaptic+plasticity+in+age-related+memory+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Involvement of hippocampal synaptic plasticity in age-related memory decline.</a> Brain Res Brain Res Rev. 30, 236-249 (1999).</li>
<li>Foster, T. C., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+to+induction+of+long-term+depression+is+associated+with+impaired+memory+in+aged+Fischer+344+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Susceptibility to induction of long-term depression is associated with impaired memory in aged Fischer 344 rats.</a> Neurobiol Learn Mem. 87, 522-535 (2007).</li>
<li>Hsu, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+the+balance+of+protein+kinase+and+phosphatase+activities+and+age-related+impairments+of+synaptic+transmission+and+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Alterations in the balance of protein kinase and phosphatase activities and age-related impairments of synaptic transmission and long-term potentiation.</a> Hippocampus. 12, 787-802 (2002).</li>
<li>Vouimba, R. M., Foy, M. R., Foy, J. G., Thompson, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((17beta-estradiol+suppresses+expression+of+long-term+depression+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">17beta-estradiol suppresses expression of long-term depression in aged rats.</a> Brain Res Bull. 53, 783-787 (2000).</li>
<li>Abdul, H. M., Furman, J. L., Sama, M. A., Mathis, D. M., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFATs+and+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">NFATs and Alzheimer's Disease.</a> Mol Cell Pharmacol. 2, 7-14 (2010).</li>
<li>Abdul, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+decline+in+Alzheimer%27s+disease+is+associated+with+selective+changes+in+calcineurin%2FNFAT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cognitive decline in Alzheimer's disease is associated with selective changes in calcineurin/NFAT signaling.</a> J Neurosci. 29, 12957-12969 (2009).</li>
<li>Anantharaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-amyloid+mediated+nitration+of+manganese+superoxide+dismutase%3A+implication+for+oxidative+stress+in+a+APPNLH%2FNLH+X+PS-1P264L%2FP264L+double+knock-in+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Beta-amyloid mediated nitration of manganese superoxide dismutase: implication for oxidative stress in a APPNLH/NLH X PS-1P264L/P264L double knock-in mouse model of Alzheimer's disease.</a> Am J Pathol. 168, 1608-1618 (2006).</li>
<li>Gengler, S., Hamilton, A., Holscher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+in+the+hippocampus+of+a+APP%2FPS1+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease+is+impaired+in+old+but+not+young+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity in the hippocampus of a APP/PS1 mouse model of Alzheimer's disease is impaired in old but not young mice.</a> PLoS One. 5, e9764-e9764 (2010).</li>
<li>Stringer, J. L., Lothman, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effects+of+extracellular+calcium+concentrations+on+hippocampal+pyramidal+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vitro effects of extracellular calcium concentrations on hippocampal pyramidal cell responses.</a> Exp Neurol. 101, 132-146 (1988).</li>
<li>Landfield, P. W., Pitler, T. A., Applegate, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+high+Mg2%2B-to-Ca2%2B+ratios+on+frequency+potentiation+in+hippocampal+slices+of+young+and+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The effects of high Mg2+-to-Ca2+ ratios on frequency potentiation in hippocampal slices of young and aged rats.</a> J Neurophysiol. 56, 797-811 (1986).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Sakanoue, M., Endo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NA%2C+K%2C+CA%2C+MG%2C+AND+C1+CONCENTRATIONS+IN+CHOROID+PLEXUS+FLUID+AND+CISTERNAL+FLUID+COMPARED+WITH+PLASMA+ULTRAFILTRATE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">NA, K, CA, MG, AND C1 CONCENTRATIONS IN CHOROID PLEXUS FLUID AND CISTERNAL FLUID COMPARED WITH PLASMA ULTRAFILTRATE.</a> J Neurophysiol. 27, 672-681 (1964).</li>
<li>Gant, J. C., Sama, M. M., Landfield, P. W., Thibault, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+and+simultaneous+emergence+of+multiple+hippocampal+biomarkers+of+aging+is+mediated+by+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early and simultaneous emergence of multiple hippocampal biomarkers of aging is mediated by Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Neurosci. 26, 3482-3490 (2006).</li>
<li>Thibault, O., Hadley, R., Landfield, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+postsynaptic+%5BCa2%2B%5Di+and+L-type+calcium+channel+activity+in+aged+hippocampal+neurons%3A+relationship+to+impaired+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Elevated postsynaptic [Ca2+]i and L-type calcium channel activity in aged hippocampal neurons: relationship to impaired synaptic plasticity.</a> J Neurosci. 21, 9744-9756 (2001).</li>
<li>Thibault, O., Landfield, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+single+L-type+calcium+channels+in+hippocampal+neurons+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Increase in single L-type calcium channels in hippocampal neurons during aging.</a> Science. 272, 1017-1020 (1996).</li>
<li>Stutzmann, G. E., Caccamo, A., LaFerla, F. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+IP3+signaling+in+cortical+neurons+of+knock-in+mice+expressing+an+Alzheimer%27s-linked+mutation+in+presenilin1+results+in+exaggerated+Ca2%2B+signals+and+altered+membrane+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dysregulated IP3 signaling in cortical neurons of knock-in mice expressing an Alzheimer's-linked mutation in presenilin1 results in exaggerated Ca2+ signals and altered membrane excitability.</a> J Neurosci. 24, 508-513 (2004).</li>
<li>Stutzmann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+ryanodine+receptor+recruitment+contributes+to+Ca2%2B+disruptions+in+young%2C+adult%2C+and+aged+Alzheimer%27s+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhanced ryanodine receptor recruitment contributes to Ca2+ disruptions in young, adult, and aged Alzheimer's disease mice.</a> J Neurosci. 26, 5180-5189 (2006).</li>
<li>Lee, H. K., Min, S. S., Gallagher, M., Kirkwood, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-independent+long-term+depression+correlates+with+successful+aging+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-independent long-term depression correlates with successful aging in rats.</a> Nat Neurosci. 8, 1657-1659 (2005).</li>
<li>McNaughton, B. L., Douglas, R. M., Goddard, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+enhancement+in+fascia+dentata%3A+cooperativity+among+coactive+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic enhancement in fascia dentata: cooperativity among coactive afferents.</a> Brain Res. 157, 277-293 (1978).</li>
</ol>

La produzione di questo video-articolo è stato sponsorizzato da Leica Microsystems.

La procedura descritta in questo protocollo aiuterà ad assicurare che dissezioni del cervello sono effettuati almeno più rapidamente ed efficacemente in età, come nei ratti adulti giovani. Inoltre fornisce dettagli sufficienti per il principiante di stabilire la loro fetta propri studi su LTP e LTD. Se ulteriori esplorazioni di invecchiamento e le modifiche dC in funzione sinaptica e la plasticità è uno dei vostri obiettivi, ci sono almeno due altre questioni metodologiche, accennato sopra, che meritano ulteriore considerazione. In primo luogo, molti laboratori hanno dimostrato che il Ca 2 +: Mg2 + in rapporto registrazione ACSF può avere un effetto marcato sulla plasticità sinaptica induzione in fettine di ippocampo 2,10,24,25. Nel liquor dei mammiferi, il Ca 2 +: Mg2 + rapporto è di circa un (vedi ad esempio 26). Tuttavia, ACSF Ca 2 +: Mg2 + rapporto più vicino al 2 sono comunemente utilizzati negli studi fetta di funzione sinaptica e della plasticità. Nei primi studi, questa pratica era probabilmente adattato per ottimizzare l&#39;induzione di LTP, poi successivamente è diventato di routine per tutti gli studi plasticità. Tuttavia, questa pratica può essere problematico in studi di invecchiamento e dC a causa delle differenze ben caratterizzato in neuronale Ca 2 + regolamento. In particolare, Ca 2 + afflusso e / o Ca 2 + indotto da Ca 2 +-release è elevato in ratti anziani e / o topi modello dC durante l&#39;attivazione neuronale 3,27-31. Induzione di LTD è particolarmente sensibile ai cambiamenti sottili ACSF Ca 2 + livelli. Il nostro protocollo, che utilizza 2mM Ca 2 + e 2 mM Mg2 +, comunemente risultati LTD per anziani, ma non animali giovani adulti 2, mentre gli studi con un Ca 2 +: Mg2 rapporto + vicino a due, hanno osservato LTD robusto negli adulti in assenza di una differenza di età 2,10 o in combinazione con LTD ridotto nei ratti di 32 anni. Queste osservazioni evidenziano la necessità di considerare attentamente ACSF Ca 2 + e Mg2 + quando si confrontano livelli di Ca 2 +-dipendente plasticità in animali adulti anziani e giovani. Il secondo problema metodologico riguarda la forte dipendenza della LTP in depolarizzazione postsinaptica 33 e possibile l&#39;invecchiamento / genotipo differenze nella forza sinaptica. In un esperimento tipico LTP, al basale e l&#39;intensità di stimolazione LTP è generalmente regolata per produrre una mezza massimo (o di tre quarti massima) EPSP ampiezza. Il problema potenziale è che ratti anziani e APP/PS1 topi di solito mostrano una ridotta forza sinaptica rispetto alle loro controparti più giovani tipo e / o selvatici, il che significa che i valori basali EPSP sarà anche più piccolo in ratti anziani e APP/PS1 topi. Piccoli EPSPS può tradurre a meno depolarizzazione durante la stimolazione LTP, con un conseguente probabilità ridotta per indurre LTP 33. A causa di questo potenziale confondere, è difficile stabilire se questi animali presentano un deficit di produttività, un deficit di plasticità o entrambi. Cioè, i meccanismi di induzione LTP in età e / o APP/PS1 topi possono essere funzionalmente intatta (nessun deficit di plasticità), ma non sufficientemente stimolato (deficit di throughput) in queste condizioni. Questa distinzione è fondamentale, come i meccanismi di velocità e meccanismi di plasticità può rispondere in modo molto diverso a un determinato trattamento farmacologico. Cerchiamo di minimizzare l&#39;impatto di throughput ridotto sull&#39;induzione LTP normalizzando l&#39;ampiezza EPSP allo stesso livello (ad esempio 1 mV) in tutte le sezioni prima di stimolazione LTP. Altre strategie possono essere efficaci anche (ad esempio l&#39;uso di tensione o corrente pinza per equalizzare il potenziale di membrana tra i gruppi durante la stimolazione LTP), e deve essere considerata nell&#39;ambito delle indagini sulla LTP in questi modelli animali.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Pescatore </td><td> BP358-1 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Pescatore </td><td> BP366-500 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 (monobasico) </td><td> Sigma </td><td> P5379-100G </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> Sigma </td><td> M2643-500G </td></tr><tr><td> CaCl 2 (diidrato) </td><td> Sigma </td><td> C3306-250G </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Pescatore </td><td> S233-500 </td></tr><tr><td> C 6 H 12 O 6 (destrosio) </td><td> Pescatore </td><td> BP350-1 </td></tr></tbody></table> Reagenti Tabella 1. Necessaria <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Beute </td><td> Pescatore </td><td> FB-500-2000 FB-500-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Acquario Bubbler </td><td></td><td></td><td> Utilizzati per i media ossigenante. Disponibile nella maggior parte negozi di animali </td></tr><tr><td> 50 ml di vetro bicchiere </td><td> Pescatore </td><td> 02-540g </td><td> Per storarge cervello in ACSF </td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Pescatore </td><td> 13-374-10 </td><td></td></tr><tr><td> Animali piccola ghigliottina </td><td> Mondo Strumenti di precisione (WPI) </td><td> DCAP-M </td><td></td></tr><tr><td> Tovagliolo di carta piatto </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> # 11 Feather lama chirurgica </td><td> Pescatore </td><td> 08-916-5B </td><td></td></tr><tr><td> Beebee osso forbici </td><td> Strumenti Scienza Fine (FST) </td><td> 16044-10 </td><td></td></tr><tr><td> Lempert Rongeurs </td><td> Roboz </td><td> RS-8321 </td><td> Utilizzare per i ratti </td></tr><tr><td> Friedman-Pearson Rongeurs </td><td> FST </td><td> 16020-14 </td><td> Da utilizzare per topi o ratti </td></tr><tr><td> Hippocampus strumento </td><td> FST </td><td> 10099-15 </td><td></td></tr><tr><td> Cucchiaio </td><td></td><td></td><td> Un cucchiaino di plastica farà </td></tr><tr><td> Spatola </td><td> Pescatore </td><td> 21-401-25A </td><td> Spatola </td></tr><tr><td> Iris forbici chirurgiche </td><td> FST </td><td> 14058-09 </td><td></td></tr><tr><td> pipette di trasferimento di plastica </td><td> Pescatore </td><td> 13-711-43 </td><td></td></tr><tr><td> 110 millimetri filtro di carta Whatman </td><td> Pescatore </td><td> 09-805E </td><td> Cat Whatman. 1001-110 </td></tr><tr><td> Vetro scatola di Petri </td><td> Pescatore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Leica VT1000P manuale vibrante microtomo </td><td> Vibratome </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,1 millimetri FA-10 Feather S lama </td><td> Ted Pella </td><td> 121-9 </td><td> 0,1 millimetri FA-10 Feather S lama </td></tr><tr><td> Pipettare Pasteur in vetro borosilicato (con gommino) </td><td> Pescatore </td><td> 13-678-20A </td><td> Per il trasferimento di fette: Tip è rotto e il calore-lucido per le più grandi di apertura </td></tr><tr><td> Piatto 35 millimetri Cultura Polysterine </td><td> Corning </td><td> 430588 </td><td> Utilizzati per la raccolta fette dopo la dissezione </td></tr></tbody></table> Strumenti tabella 2. E materiali per la dissezione <table border="1"><tbody><tr><td> Attrezzature / Materiali </td><td> Azienda </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Tenendo camera </td><td> Custom Built </td><td></td></tr><tr><td> P-97 orizzontale pipette Puller </td><td> Sutter Instrument Co. </td><td></td></tr><tr><td> Isolamento dalle vibrazioni tavolo </td><td> Tecnico Manufacturing Corporation (TMC) </td><td></td></tr><tr><td> Gabbia di Faraday </td><td> Su misura </td><td></td></tr><tr><td> Pirex Bottiglia Aspiratore con Sidearm inferiore (Product # 1220-1L) </td><td> Corning </td><td></td></tr><tr><td> Gravità contolled serie IV con regolatore (Product # 2C8891) </td><td> Baxter </td><td></td></tr><tr><td> Vuoto Central Line </td><td></td><td> Disponibile nella maggior parte dei laboratori moderni </td></tr><tr><td> 95% O 2 / 5% di CO 2 Mix Gas </td><td> Scozzeset-Gross Co. </td><td></td></tr><tr><td> TygonTM Lab tubi Per O 2 / CO 2 di consegna </td><td> Fisher Scientific </td><td> Non tossico, non ossidanti, è disponibile in una varietà di formati. </td></tr><tr><td> Eclipse E600FN Microscopio </td><td> Nikon </td><td> con obiettivi 10x e 40x, vicino infared filtro, e GFP, DS-Rosso2 filtri </td></tr><tr><td> Raffreddare ES Snap Digital Camera </td><td> Fotometrici </td><td> Raffreddare ES Snap Digital Camera </td></tr><tr><td> X-Cite Illuminatore fluorescente </td><td> EXFO </td><td> X-Cite Illuminatore fluorescente </td></tr><tr><td> Microscopio Piattaforma </td><td> Siskiyou </td><td> Assemblati su misura </td></tr><tr><td> RC-22 sommergibili camera di registrazione (Product # 64-0228) </td><td> Warner Instruments (WI) </td><td> Richiede P-1 adattatore piattaforma e lo stadio (Product # 64-0277 da Warner) </td></tr><tr><td> TC2BIP 2/3Ch Regolatore di temperatura </td><td> Cellula Microcontrols </td><td> TC2BIP 2/3Ch Regolatore di temperatura </td></tr><tr><td> 4 assi manuale manipolatore in miniatura </td><td> Siskiyou </td><td></td></tr><tr><td> Filo di platino iridio (0,002 in) (Articolo # PTT0203) </td><td> WPI </td><td></td></tr><tr><td> A365 Stimolo isolatore </td><td> WPI </td><td> A365 Stimolo isolatore </td></tr><tr><td> Multiclamp Amplificatore 700B </td><td> Axon Instruments </td><td></td></tr><tr><td> Digidata 1322A convertitore A / D </td><td> Axon Instruments </td><td></td></tr><tr><td> PClamp software </td><td> Axon Instruments </td><td></td></tr><tr><td> Personal Computer (Pentium 4) </td><td> Conca </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 3. Elettrofisiologia attrezzature e materiali

preparazione di acuta fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche durante l&#39;invecchiamento e amiloide patologia

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

L&#39;ippocampo preparazione fetta roditore è forse lo strumento più largamente utilizzato per lo studio dei mammiferi funzione sinaptica e la plasticità. L&#39;ippocampo può essere estratto rapidamente e facilmente da ratti e topi e fette rimangono vitali per ore in ossigenato artificiale liquido cerebrospinale. Inoltre, le tecniche di base electrophysisologic sono facilmente applicati allo studio di funzione sinaptica in fettine di ippocampo e hanno fornito alcuni dei migliori marcatori di disturbi cognitivi. La fetta ippocampo è particolarmente popolare per lo studio dei meccanismi di plasticità sinaptica coinvolti nell&#39;apprendimento e nella memoria. Cambiamenti nella induzione di potenziamento a lungo termine e la depressione (LTP e LTD) di efficacia sinaptica in fettine di ippocampo (o la loro mancanza) sono spesso usate per descrivere il fenotipo neurologico di animali con problemi cognitivo e / o per valutare il meccanismo d&#39;azione di composti nootropica. Questo articolo descrive le procedure che utilizziamo per la preparazione di fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche del cervello associata con l&#39;invecchiamento e la malattia di Alzheimer (AD) 1-3. Uso dei ratti anziani e topi modello AD può presentare una serie di sfide per i ricercatori abituati ad usare i ratti più giovani e / o topi nelle loro ricerche. Ratti anziani hanno spesso teschi e più dura del tessuto connettivo più giovani ratti e topi, che può ritardare l&#39;estrazione del cervello e / o di dissezione e di conseguenza negare o esagerare reali differenze età-correlate in funzione sinaptica e la plasticità. Invecchiamento e patologia amiloide può anche aggravare i danni subiti dell&#39;ippocampo durante la procedura di dissezione, di nuovo complicando ogni deduzioni tratte dalla valutazione fisiologica. Qui, discutiamo i passi compiuti durante la procedura di dissezione per minimizzare questi problemi. Esempi di risposte sinaptiche acquisite in &quot;buona salute&quot; e &quot;malsana&quot; fette di ratti e topi vengono forniti, oltre che rappresentante esperimenti di plasticità sinaptica. L&#39;eventuale impatto di altri fattori metodologici sulla funzione sinaptica in questi modelli animali (ad esempio i componenti della soluzione di registrazione, i parametri di stimolazione) vengono anche discussi. Mentre l&#39;attenzione di questo articolo è l&#39;utilizzo di ratti anziani e topi transgenici, i novizi di tagliare fisiologia dovrebbe trovare abbastanza dettagli qui per iniziare i propri studi, utilizzando una varietà di modelli di roditori.

Questo articolo descrive le procedure per la preparazione di fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche associate con l&#39;invecchiamento cerebrale e le malattie neurodegenerative legate all&#39;età, come la malattia di Alzheimer.

Preparazione di acuta fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche durante l&#39;invecchiamento e Amiloide Patologia

La preparazione di fette ippocampali di roditore è probabilmente lo strumento più ampiamente utilizzato per indagare la funzione e la plasticità sinaptica dei mammiferi. La ...

Le sezioni ippocampali di roditori sono comunemente utilizzate nello studio della funzione e plasticità sinaptica dei mammiferi. Qui illustriamo un protocollo per ottenere e studiare sezioni da ratti e topi anziani, che presentano crani più spessi e tessuti connettivi più resistenti rispetto ai ratti e ai topi giovani. Queste caratteristiche possono ritardare l'estrazione del cervello o la dissezione, e di conseguenza annullare o esagerare le reali differenze legate all'età nella funzione e plasticità sinaptica.Inoltre, l'invecchiamento e la patologia amiloide potrebbero aggravare i danni all'ippocampo subiti durante la procedura di dissezione, complicando ulteriormente le conclusioni tratte dalla valutazione fisiologica. In questa dimostrazione, illustreremo le misure adottate durante le procedure di estrazione e dissezione per ridurre al minimo questi problemi. Innanzitutto, il cervello viene rapidamente estratto e collocato in una soluzione salina cerebrale artificiale fredda, a basso contenuto di calcio e ghiacciata.I campi dell'ippocampo vengono quindi delicatamente rimossi su un piano di dissezione ghiacciato e le sezioni ippocampali sono preparate utilizzando un vibratome e incubate in un liquido cerebrospinale (A CSF) contenente calcio e ossigenato. Infine, potenziali e correnti sinaptiche sono evocati in molteplici sottoregioni ippocampali e registrati; i risultati ottenuti dimostrano gli effetti dell'invecchiamento e/o di una patologia simile all'Alzheimer sulla funzione e plasticità sinaptica. L'uso corretto di questa tecnica ha implicazioni per il declino cognitivo legato all'età e la demenza causata dalla malattia di Alzheimer.Ciò è dovuto al fatto che la disfunzione sinaptica è tra i biomarcatori più precoci di questi sintomi clinici, come dimostra questa procedura. Oggi sarà il dottor Chris Norris, il responsabile del laboratorio, accanto a un grande lavandino. Preparare l'area di dissezione per l'asportazione del cervello e la dissezione dell'ippocampo.Includere un tovagliolo di carta piegato, una lama di bisturi numero 11, forbici BB, pinze per ossa e uno strumento per ippocampo, una spatola doppia specializzata proveniente da strumenti chirurgici fini. Posizionare inoltre piccole forbici chirurgiche, una spatola sottile, una pipetta di plastica, carta da filtro Whatman, una piastra di Petri di vetro da 100 millimetri piena di ghiaccio, un cucchiaio di plastica e un becher contenente soluzione priva di calcio parzialmente scongelata. Un liquido cerebrospinale coperto con parafilm.Dopo la decapitazione del ratto, il cervello deve essere estratto nel più breve tempo possibile. Posizionare la testa sul tovagliolo di carta e, utilizzando rapidamente il bisturi, praticare un'incisione al centro del cuoio capelluto, dallo zigomo nasale fino all'osso occipitale.Assicurarsi di tagliare completamente il muscolo cutaneo, esponendo pienamente le suture del cranio. Tenere saldamente la testa e tagliare attraverso le placche occipitale, parietale e frontale lungo la sutura mediana. È fondamentale mantenere la parte inferiore delle forbici ben aderente alla superficie interna del cranio e lontana dal cervello.Questo è fondamentale per evitare graffi accidentali. Prossima diapositiva. I Ron vengono posizionati sotto la placca parietale sinistra e le ganasce vengono serrate insieme, ruotando verso l'alto e in avanti per staccare le placche parietale e occipitale.Se necessario, utilizzare le pinze Ron per rimuovere anche la placca frontale sinistra. Ripetere l'operazione per l'emisfero controlaterale. Una volta spostate le placche, utilizzare le pinze Ron o le forbici per staccare delicatamente o tagliare qualsiasi dura madre che potrebbe essere attaccata alle placche temporali e distesa sulla superficie del cervello.Ora far scivolare i forceps di Rongeur tra il cervello e la placca temporale destra, esercitando pressione verso il cranio e lontano dal cervello. Stringere e ruotare la placca temporale fino a quando si sente o si percepisce uno scricchiolio. Ripetere l'operazione sul lato sinistro.Fare scivolare la spatola larga davanti allo strumento per l'ippocampo tra la superficie ventrale del cervello e le piastre ossee inferiori del cranio, fino a quando non si trova completamente al di sotto del cervello. Muoverla lateralmente da un lato all'altro e avanti e indietro alcune volte per recidere i nervi cranici ancora integri, utilizzando lo strumento per l'ippocampo. Sollevare il cervello e immergerlo in una soluzione di A CSF priva di calcio coperta con Parfum, lasciandolo raffreddare per circa un minuto.Per estrarre i campi ippocampali, utilizzare un cucchiaino per prelevare il cervello dal liquido cefalorachidiano (CSF) e posizionarlo su un foglio di carta Watman inumidito con CSF, appoggiato sul coperchio di una piastra di Petri fredda. Utilizzando la lama del bisturi, rimuovere il cervelletto e circa un quarto dei lobi frontali rostrali. A questo punto, tagliare attraverso la scissura interemisferica per separare completamente i due emisferi.Posizionare un emisfero nuovamente nella miscela di liquido cefalorachidiano e mantenere l'altro in posizione verticale sulla piastra di dissezione in modo che il piano coronale del lobo frontale sia rivolto verso il basso; il tronco encefalico e il mesencefalo bianchi dovrebbero essere facilmente distinguibili dalla corteccia sovrastante di colore rosa o grigiastro. Individuare i collicoli sul mesencefalo. Questi appariranno come due protuberanze bianche e si troveranno nella parte superiore del cervello.In questa orientazione, tenere delicatamente il mesencefalo in posizione con le forbici e far scivolare la spatola tra i corpi callosi e la corteccia. Quindi tirare delicatamente il bulbo, il mesencefalo e il talamo. Potrebbe essere necessario recidere con le forbici tessuto connettivo o vascolarizzazione.Utilizzare il bordo affilato della spatola per recidere il fornice, un fascio di fibre bianche situato nella porzione dorsale anteriore dell'ippocampo. Con le forbici, continuare delicatamente a tirare il tronco encefalico, il mesencefalo e il talamo senza staccarli completamente dal resto del cervello.Le fibre bianche che formano una leggera iperbole nella parte inferiore dell'ippocampo dovrebbero ora essere visibili in questa orientazione. Utilizzando la pipetta di trasferimento, spruzzare delicatamente un po' di ACSF nella fessura al di sotto della FIA per favorire la separazione dell'ippocampo dalla corteccia. Inserire delicatamente la spatola in questa fessura e, tenendo saldamente tronco encefalico, mesencefalo e talamo con le forbici, ruotare dolcemente l'ippocampo e rimuovere con cura qualsiasi residuo di corteccia, vasi sanguigni e sostanza bianca dall'ippocampo.Inumidire con alcuni millilitri di A CSF. Utilizzando la pipetta di trasferimento, mantenere il tessuto umido e freddo con una miscela ghiacciata di CSF. Successivamente, rimuovere l'altro emisfero e ripetere la dissezione per sezionare i campi ippocampali del ratto.Riempire il serbatoio del vibratome con A CSF ghiacciato e privo di calcio, in modo che il piano di taglio e la lama siano completamente immersi. Utilizzare un bisturi per rimuovere le estremit&agrave; rostrale e caudale di ciascun ippocampo e posizionarli insieme sulle superfici rostrali, con il giro dentato di ciascun ippocampo rivolto verso l'altro. Incollare il tessuto cerebrale su un blocco di supporto e trasferirlo sulla piattaforma di sezionamento del vibratome.Per esperimenti di fisiologia sinaptica, si raccomandano sezioni di 400 micrometri. Utilizzando una pipetta di trasferimento a bocca larga, trasferire le sezioni in una piccola capsula di Petri contenente soluzione fisiologica artificiale (CSF) priva di calcio e fredda di ghiaccio.Una volta completato il taglio, le sezioni vengono trasferite nella camera di conservazione, riempita con A CSF contenente calcio e ossigenato. Portare gradualmente la camera da 27 a 32 gradi Celsius per effettuare registrazioni extracellulari di base. In sezioni acute, la camera di registrazione è posizionata sul tavolo del microscopio, in modo che l'A CSF preriscaldato venga introdotto per gravità attraverso un regolatore di flusso ed eliminato tramite una linea centrale sotto vuoto.Utilizzando un piccolo pennello, trasferire una sezione nella camera di registrazione in modo che sia immersa nell'ACSF e appoggiata sulla rete inserita. Lasciare che la sezione si adatti per 10-15 minuti. Mentre la sezione si sta adattando, accendere lo stimolatore o l'isolatore di stimolo e regolare l'uscita a zero.Quindi posizionare un elettrodo stimolante sopra la sezione nel campo stratum radiatum della regione CA2 vicino al confine con CA3. Abbassare l'elettrodo di registrazione nello stratum radiatum di CA1, appena sotto la superficie della sezione. Aumentare l'uscita dello stimolatore a un livello moderato.L'isolatore dello stimolo è impostato a circa 150 microampere. Abbassare lentamente l'elettrodo stimolante a piccoli intervalli finché non viene registrato un artefatto di stimolazione. In ca uno, continuare ad abbassare lentamente sia l'elettrodo stimolante che quello di registrazione a intervalli, acquisendo contemporaneamente le risposte di ca uno.Stabilire una curva di forza sinaptica finché le ampiezze del volley fibrillare e del potenziale postsinaptico eccitatorio non raggiungono livelli massimali utilizzando un programma di acquisizione software come Clampex. Quindi utilizzare il software per erogare stimoli a una serie di intensità e registrare l'attività corrispondente nel CA1. L'intervallo e il numero di livelli di intensità dello stimolo utilizzati devono essere sufficienti a generare una curva sigmoidea quando rappresentati in grafico rispetto ai valori di FV o EPSP.Successivamente, per studiare la plasticità sinaptica, reimpostare l'intensità dello stimolo per ciascuna fetta in modo da ottenere una risposta di un millivolt. Iniziare la stimolazione di base a una frequenza di 0,033 hertz EPSP. I valori della pendenza dovrebbero rimanere stabili per almeno 20 minuti prima dell'induzione della potenziamento a lungo termine LTP o della depressione a lungo termine LTD.Per registrare un periodo di baseline, utilizzare un file di parametri clamp X per stimolare e registrare ogni 30 secondi. Successivamente, per indurre la PTP, aprire un file di parametri separato per indurre la PTP mediante un traino di stimolazione di 100 hertz della durata di un secondo oppure mediante brevi impulsi di stimolazione a 200 hertz somministrati ogni 200 millisecondi per l'induzione della DTP. Somministrare 900 impulsi di stimolazione a una frequenza di un hertz.Dopo che i treni di stimolazione tornano al file di parametri di base, registrare le risposte sinaptiche per 60 minuti o più. Confrontare i valori della pendenza del PEPS ottenuti prima e 60 minuti dopo la stimolazione a bassa frequenza per determinare la presenza di potenziamento a lungo termine (LTP), indicato da un aumento della forza sinaptica, o di depotenziamento a lungo termine (LTD), indicato da una diminuzione della forza sinaptica. Si ritiene generalmente che entrambi i processi riflettano meccanismi fondamentali per l'apprendimento e la memoria.Qui vengono mostrate curve rappresentative della forza sinaptica ottenute da due diverse fette ippocampali di due topi A PP PS.One. Un topo è stato trattato con un nuovo reagente virale adeno-associato anti-infiammatorio. L'altro è stato trattato con un reagente virale controllato.Come si può osservare quando un numero simile di fibre presinaptiche viene attivato tra le diverse condizioni sperimentali. Quando i gruppi mostrano ampiezze del FV simili, come indicato sull'asse x, la curva del trancio trattato con il reagente a è spostata verso sinistra, indicando ampiezze maggiori del PPSE. Questi dati dimostrano che la forza sinaptica di base è maggiore nel trancio trattato con il reagente a.Ecco i risultati di esperimenti di PTL effettuati sulle stesse fette. Si noti che i valori della pendenza del PSPE nella fetta con il reagente a sono molto maggiori rispetto alla fetta di controllo durante l'ora di baseline successiva alla somministrazione di una stimolazione a 100 hertz, indicando che la PTL era presente nella fetta con il reagente a ma non nella fetta di controllo. Questa figura mostra l'aspetto delle forme d'onda del PSPE nelle fette di topo trattate con il reagente A e nelle fette di controllo prima e 60 minuti dopo la somministrazione di una stimolazione a 100 hertz.L'aumento della pendenza del PSPE nel periodo post 100 hertz è molto evidente nella fetta trattata con il reagente A, indicativo di LTP. Gli esperimenti mostrati nelle figure finora presentate indicano che il reagente A aumenta la forza sinaptica e attenua i deficit di LTP. In topi PP PS uno, esperimenti simili sono stati effettuati su LACS ippocampali di ratti anziani.Qui vengono mostrate le curve di forza sinaptica ottenute da due diverse fette di ippocampo di un ratto trattato con un nuovo farmaco antinfiammatorio e di un altro ratto trattato con un veicolo di controllo. Si noti che queste curve sono molto simili per le due fette, indicando che il farmaco A ha un effetto minimo sulla forza sinaptica basale. Questa figura mostra i risultati di esperimenti di LTD eseguiti sulle stesse fette.Si noti che, tipicamente nei ratti anziani, i valori della pendenza del PEPS nella sezione trattata con veicolo risultano ridotti durante la fase di baseline di un'ora successiva alla somministrazione della stimolazione a un hertz. Tuttavia, i valori della pendenza del PEPS nella sezione trattata con il farmaco A mostrano una riduzione minima o nulla, indicando l'assenza di DLTD. Qui vengono mostrate le forme d'onda del PEPS registrate nelle sezioni di ratti trattati con farmaco A e con veicolo prima e 60 minuti dopo la stimolazione a un hertz. La diminuzione della pendenza del PEPS nel periodo successivo alla stimolazione a un hertz è molto evidente nella sezione con veicolo, ma non nella sezione con farmaco A.I risultati mostrati in queste figure indicano che il farmaco a migliora le differenze di plasticità nei ratti anziani bloccando l'induzione della LTD, ma non influisce sulla funzione sinaptica basale. Questi dati dimostrano che diversi parametri della funzione sinaptica e della plasticità nei ratti anziani e nei topi modello di Alzheimer possono essere modulati da trattamenti sperimentali, evidenziando l'utilità delle fette ippocampali acute nello studio del potenziale nootropo e/o neuroprotettivo di nuovi farmaci e reagenti sperimentali. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di bilanciare la rapidità nell'estrazione del cervello con la precisione e la delicatezza durante la dissezione, il taglio e la manipolazione dell'ippocampo per le misurazioni elettrofisiologiche.

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Preparazione di acuta fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche durante linvecchiamento e Amiloide Patologia (Video) | JoVE Journal

Preparazione di acuta fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche durante l'invecchiamento e Amiloide Patologia

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