Preparazione di acuta fettine di ippocampo di ratti e topi transgenici per lo studio delle alterazioni sinaptiche durante l'invecchiamento e Amiloide Patologia

Le fette di ippocampo per roditori sono spesso utilizzate nello studio della funzione sinaptica e della plasticità dei mammiferi. Qui dimostriamo un protocollo per ottenere e studiare fette di ratti e topi anziani, che hanno crani più spessi e tessuto connettivo più duro rispetto ai ratti e ai topi più giovani. Queste caratteristiche possono ritardare l'estrazione e/o la dissezione del cervello e, di conseguenza, negare o esagerare le differenze reali di età nella funzione sinaptica e nella plasticità.

Inoltre, l'invecchiamento e la patologia amiloide possono esacerbare il danno ippocampale subito durante la procedura di dissezione, complicando ulteriormente qualsiasi inferenza tratta dalla valutazione fisiologica. In questa dimostrazione, discutiamo le misure adottate durante le procedure di estrazione e dissezione per ridurre al minimo questi problemi. In primo luogo, il cervello viene rapidamente estratto e posto nel ghiaccio, freddo, a basso contenuto di calcio, nel liquido cerebrospinale artificiale.

I campi dell'ippopotamo vengono quindi rimossi delicatamente in una fase di dissezione ghiacciata e le fette dell'ippocampo vengono preparate utilizzando un vibrato e incubate in calcio ossigenato contenente A CSF. Infine, i potenziali e le correnti sinaptiche vengono evocati in più sottoregioni dell'ippocampo e registrati i risultati ottenuti dimostrano gli effetti dell'invecchiamento e/o della patologia simile all'Alzheimer sulla funzione sinaptica e sulla plasticità. L'uso corretto di questa tecnica ha implicazioni per il declino cognitivo legato all'età e la demenza dovuta al morbo di Alzheimer.

Questo perché la disfunzione sinaptica è tra i primi biomarcatori di questi sintomi clinici che dimostrano questa procedura. Oggi sarà il dottor Chris Norris, il PI del laboratorio accanto a un grande lavandino. Preparare l'area di dissezione per la rimozione del cervello e la dissezione dell'ippocampo.

Include un tovagliolo di carta piegato, una lama di bisturi numero 11, forbici BB, urs ossei e uno strumento per ippocampo, una doppia spatola specializzata da uno strumento chirurgico fine. Posizionare anche piccole forbici chirurgiche, una spatola sottile, una pipetta di plastica watman, carta da filtro, una capsula di Petri di vetro da 100 millimetri riempita di ghiaccio, un cucchiaio di plastica e un becher di calcio parzialmente scongelato. Un liquido cerebrospinale coperto di param.

Dopo la decapitazione del topo. Il cervello dovrebbe essere estratto il più rapidamente possibile. Posiziona la testa sul tovagliolo di carta usando il bisturi, fai rapidamente un'incisione al centro del cuoio capelluto dall'osso nasale all'osso occipitale.

Assicurati di tagliare completamente il muscolo cutaneo, esponendo completamente le suture del cranio. Tenere saldamente la testa e tagliare le placche occipitale, parietale e frontale lungo la sutura della linea mediana. Assicurati di tenere le cesoie inferiori saldamente contro la superficie interna del cranio e lontano dal cervello.

Questo è fondamentale per prevenire scriccature involontarie. Prossima diapositiva. I giurati di Ron si sottopongono alla placca parietale sinistra e stringono insieme le mascelle, rotolando verso l'alto e in avanti per tirare via le placche parietale e occipitale.

Se necessario, usa i giurati Ron per rimuovere anche la piastra frontale sinistra. Ripetere per l'altro emisfero. Una volta che le placche sono state spostate, usa i giurati Ron o le forbici per tirare via o tagliare delicatamente qualsiasi dura madre che può essere attaccata alle placche temporali e tesa sulla superficie del cervello.

Ora fate scivolare i giurati di Ron tra il cervello e la piastra temporale destra, mantenendo la pressione verso il cranio e lontano dal cervello. Stringere e torcere la piastra temporale fino a quando non si sente o si avverte uno scricchiolio. Ripeti per il lato sinistro.

Far scorrere l'ampia spatola davanti allo strumento ippocampale tra la superficie ventrale del cervello e le placche craniche inferiori fino a quando non è completamente sotto il cervello. Spostalo lateralmente da un lato all'altro e avanti e indietro alcune volte per recidere i nervi cranici intatti usando lo strumento ippocampale. Raccogli il cervello e immergilo in un liquido cerebrospinale privo di calcio, copri con Parfum e lascialo raffreddare per circa un minuto.

Per estrarre l'ippopotamo, usa un cucchiaio per recuperare il cervello dal liquido cerebrospinale A e posizionalo su una carta watman inumidita con liquido cerebrospinale sul coperchio di una capsula di Petri ghiacciata. Utilizzando la lama del bisturi, rimuovere il cervelletto e circa un quarto dei lobi frontali rostrali. Ora taglia la fessura intra emisferica per separare completamente i due emisferi.

Posizionare un emisfero nella granita del liquido cerebrospinale A e posizionare l'altro sul palco di dissezione in modo tale che il piano coronale del lobo frontale sia rivolto verso il basso, il tronco encefalico bianco e il mesencefalo dovrebbero essere facilmente distinguibili dalla corteccia sovrastante rosa o grigiastra. Individua i calli sul mesencefalo. Questi appariranno come due manopole bianche e saranno nella parte superiore del cervello.

In questo orientamento, tieni delicatamente il mesencefalo in posizione con le forbici e fai scorrere la spatola tra i calli e la corteccia. Quindi tirare via delicatamente il tronco encefalico, il mesencefalo e il talamo. Potrebbe essere necessario tagliare il tessuto connettivo o il sistema vascolare con le forbici.

Usa il bordo affilato della spatola per recidere il fornice. Un fascio di fibre bianche situato nella porzione dorsale anteriore dell'ippocampo. Con le forbici continua delicatamente a tirare via il tronco encefalico, il mesencefalo e il talamo senza separarlo completamente dal resto del cervello.

Il fi bianco delle fibre che formano un'iperbole poco profonda nella parte inferiore dell'ippocampo dovrebbe ora essere visibile in questo orientamento. Usando la pipetta di trasferimento, spruzza delicatamente un po' di A CSF nella fessura sotto il FIA per aiutare a separare l'ippocampo dalla corteccia. Fai scorrere delicatamente la spatola in questa fessura e, tenendo saldamente il tronco encefalico, il mesencefalo e il talamo con le forbici, fai rotolare via l'ippocampo e taglia delicatamente la corteccia rimanente, i vasi sanguigni e la sostanza bianca lontano dall'ippocampo.

Dous con pochi millilitri di A CSF. Utilizzando la pipetta di trasferimento, mantenere il tessuto umido e freddo con una granita per il liquido cerebrospinale. Successivamente, rimuovere l'altro emisfero e ripetere la dissezione alla sezione ratto ippopotamo Campi.

Riempire il serbatoio del vibrato con liquido cerebrospinale ghiacciato e privo di calcio in modo che il tavolino di taglio e la lama siano completamente sommersi. Usa un bisturi per tagliare le punte rostrali e coccolare di ciascun ippocampo e mettili insieme sulle superfici rostrali con il giro dentato di ciascun ippocampo uno di fronte all'altro. Incollare il tessuto cerebrale su un blocco di montaggio e trasferirlo nella fase di sezionamento del vibrato.

Per gli esperimenti di fisiologia sinaptica, si consigliano sezioni di 400 micrometri. Utilizzando una pipetta per il trasferimento a bocca larga, trasferire le fette in una piccola capsula di Petri contenente ghiaccio freddo e priva di calcio. Un liquido cerebrospinale.

Una volta completato l'affettamento, le fette vengono trasferite nella camera di mantenimento, riempita con calcio ossigenato contenente A CSF. Portare gradualmente la camera da 27 gradi a 32 gradi Celsius per eseguire le registrazioni extracellulari di base. Nelle fette acute, la camera di registrazione è disposta sul tavolino del microscopio, in modo tale che il CSF A prebellico sia alimentato per gravità attraverso un regolatore di flusso e rimosso da una linea centrale del vuoto.

Utilizzando un pennello, trasferire una fetta nella camera di registrazione in modo che sia immersa in A CSF e appoggiata sulla rete inserita. Lasciare acclimatare la fetta per 10-15 minuti. Mentre la fetta si sta acclimatando, accendere lo stimolatore o l'isolatore di stimolo e ridurre l'uscita a zero.

Quindi posizionare un elettrodo stimolante sopra la fetta nella regione dell'atomo strato radi di ca due vicino al bordo di ca tre. Abbassare l'elettrodo di registrazione nell'atomo di strato radi rompendo appena la superficie della fetta. Portare l'uscita dello stimolatore a un livello moderato.

L'isolatore di stimolo è impostato a circa 150 microampere. Abbassare lentamente l'elettrodo stimolante a piccoli intervalli fino a quando non viene registrato un artefatto stimolo. In ca uno, continuare ad abbassare lentamente sia l'elettrodo stimolante che quello di registrazione a intervalli mentre si acquisiscono risposte CA uno.

Fino a quando la raffica di fibre e le ampiezze del potenziale postsinaptico eccitatorio raggiungono i livelli massimi utilizzando un programma di acquisizione software come clamp X, stabilire una curva di forza sinaptica. Quindi utilizzare il software per erogare stimoli a una gamma di intensità e registrare l'attività corrispondente in circa uno. L'intervallo e il numero di livelli di intensità dello stimolo utilizzati dovrebbero essere sufficienti per generare una curva sigmoidale se confrontati con i valori di FV o EPSP.

Successivamente, per studiare la plasticità sinaptica, reimpostare l'intensità dello stimolo per ogni fetta in modo da ottenere una risposta di un millivolt. Iniziare la stimolazione basale a una frequenza di 0,033 hertz EPSP. I valori di pendenza devono essere stabili per almeno 20 minuti prima dell'induzione di LTP di potenziamento a lungo termine o di LTD a depressione a lungo termine.

Per registrare un periodo di riferimento, utilizzare un file di parametri clamp X per stimolare e registrare ogni 30 secondi. Accanto a indurre LTP, aprire un file di parametri separato per indurre LTP utilizzando un secondo treno di stimolazione a 100 hertz o più brevi raffiche di stimolazione a 200 hertz somministrate ogni 200 millisecondi per l'induzione LTD. Eroga 900 impulsi di stimolo a una velocità di un hertz.

Dopo lo stimolo, i treni tornano al file dei parametri di base e raccolgono le risposte sinaptiche per 60 minuti o più. Confrontare i valori di pendenza dell'EPSP ottenuti prima e 60 minuti dopo la stimolazione ad alta bassa frequenza per determinare la presenza di LTP indicata da un aumento della forza sinaptica o LTD indicata da una diminuzione della forza sinaptica. Si ritiene che entrambi i processi riflettano meccanismi critici per l'apprendimento e la memoria.

Qui, curve di forza sinaptica rappresentative da due diverse fette di ippocampo da due A PP PS. Viene mostrato un topo. Un topo è stato trattato con un nuovo reagente virale adeno-associato antinfiammatorio. L'altro è stato trattato con un reagente virale controllato.

Come si può vedere quando un numero simile di fibre presinaptiche viene attivato in tutte le condizioni di trattamento. Quando i gruppi mostrano ampiezze FV simili a quelle indicate sull'asse x, la curva a fetta del reagente viene spostata a sinistra indicando ampiezze EPSP maggiori. Questi dati dimostrano che la forza sinaptica basale è maggiore nel reagente mostrato da una fetta trattata.

Di seguito sono riportati i risultati degli esperimenti LTP eseguiti sulle stesse fette. Si noti che i valori di pendenza dell'EPSP nella fetta del reagente A sono molto maggiori rispetto alla fetta di controllo durante la linea di base di un'ora dopo l'erogazione della stimolazione a 100 hertz, indicando che l'LTP era presente nella fetta del reagente A ma non nella fetta di controllo. Questa figura mostra l'aspetto delle forme d'onda EPSP nel reagente A e nelle fette di topo di controllo prima e 60 minuti dopo l'erogazione della stimolazione a 100 hertz.

L'aumento della pendenza dell'EPSP nel periodo successivo ai 100 hertz è molto evidente nella fetta del reagente indicativa di LTP insieme. Gli esperimenti nelle figure mostrate finora indicano che il reagente A aumenta la forza sinaptica e migliora i deficit di LTP. In un topo PP PS one sono stati eseguiti esperimenti simili su LACS ippocampali da ratti anziani.

Qui, vengono mostrate le curve di forza sinaptica di due diverse fette di ippocampo di un ratto trattato con un nuovo farmaco antinfiammatorio e di un altro ratto trattato con un reagente veicolo di controllo. Si noti che queste curve sono molto simili per le due fette, indicando che il farmaco A ha scarso effetto sulla forza sinaptica basale. Questa figura mostra i risultati degli esperimenti LTD eseguiti sulle stesse fette.

Si noti che i valori di pendenza EPSP tipici per i ratti anziani nella fetta trattata con veicolo sono ridotti nel basale di un'ora dopo la somministrazione di una stimolazione her. Tuttavia, i valori di pendenza dell'EPSP nella fetta del farmaco mostrano poca o nessuna depressione, indicando l'assenza di LTD mostrati qui sono le forme d'onda EPSP dal farmaco A e le fette di ratto del veicolo prima e 60 minuti dopo l'erogazione della stimolazione a un hertz. La diminuzione della pendenza dell'EPSP nel periodo successivo a un hertz è molto evidente nella fetta del veicolo, ma non nella fetta del farmaco insieme.

I risultati di queste figure mostrano che il farmaco a migliora le differenze di plasticità nei ratti anziani bloccando l'induzione di LTD, ma non influisce sulla funzione sinaptica basale. Questi dati mostrano che molteplici parametri della funzione sinaptica e della plasticità nei ratti anziani e nei topi modello di Alzheimer possono essere modulati da trattamenti sperimentali ed evidenziano l'utilità delle fette acute dell'ippocampo per studiare il potenziale nootropico e/o neuroprotettivo di nuovi farmaci e reagenti sperimentali. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di bilanciare la velocità e l'estrazione del cervello con la precisione e la delicatezza e di sezionare, affettare e maneggiare l'ippocampo per misure elettrofisiologiche.