JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 1:30 min • March 4th, 2025
Inizia con una fetta di cervello coronale prefissata, deparaffinizzata e reidratata contenente neuroni in fase di apoptosi, caratterizzata da morte cellulare e frammentazione del DNA.
Per rilevare la morte cellulare apoptotica utilizzando il test TUNEL, trattare la fetta di cervello con l'enzima proteinasi-K.
La proteinasi-K entra nei neuroni e inattiva le DNasi, impedendo la degradazione del DNA.
Sciacquare la fetta per eliminare eventuali residui di enzimi.
Aggiungere un tampone contenente deossiuridina trifosfato marcata con colorante fluorescente, o dUTP, e la deossinucleotidiltransferasi terminale, o enzima TdT, quindi incubare.
Nei neuroni apoptotici con abbondanti frammenti di DNA, l'enzima TdT lega queste dUTP fluorescenti ai gruppi 3'-ossidrile liberi dei frammenti di DNA.
Al contrario, il DNA dei neuroni sani rimane non marcato.
Colora il tessuto con DAPI, un colorante nucleare che si lega al DNA sia nei neuroni sani che in quelli apoptotici, colorando i loro nuclei di blu.
Dopo la visualizzazione, i neuroni contenenti fluorescenza blu e verde confermano la morte cellulare apoptotica nel tessuto cerebrale.