Preparazione di sezioni cerebrali di ratto per l'analisi al microscopio elettronico dell'integrità della barriera emato-encefalica

Prendiamo un ratto sottoposto a un flusso sanguigno limitato all'emisfero cerebrale destro, con conseguente danno alla BBB.

Iniettare per via endovenosa l'albumina marcata con fluoroforo, che attraversa la BBB danneggiata, raggiungendo il cervello.

Ottenere sezioni cerebrali fissate chimicamente.

Aggiungere un tampone di blocco per impedire il legame di anticorpi non specifici.

Applicare anticorpi coniugati con perossidasi che hanno come bersaglio l'albumina marcata con fluoroforo.

Aggiungere un substrato cromogenico, che la perossidasi converte in un precipitato denso di elettroni.

Introdurre il tetrossido di osmio per fissare i lipidi di membrana e migliorare il contrasto.

Disidratare le sezioni con concentrazioni di alcol crescenti.

Aggiungi l'acetato di uranile, che si lega agli acidi nucleici e alle proteine per aumentare il contrasto.

Disidratare nuovamente con concentrazioni crescenti di alcol, terminando con ossido di propilene per l'inclusione della resina. Incorporare le sezioni in resina.

Identificare e asportare al microscopio le regioni colorate di cromogeno.

Reinserire queste sezioni nella resina e preparare delle fette ultrasottili.

Montare le fette su griglie di microscopia elettronica (EM).

Colorare con citrato di piombo per migliorare il contrasto della matrice extracellulare.

Procedere con EM per esaminare l'integrità della BBB.