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Neuroscienze
0 visualizzazioni • 1:30 min • March 4th, 2025
Prendiamo un tessuto cerebrale umano fissato in formalina e incorporato in paraffina. Il tessuto presenta microbi patogeni presenti sia all'interno delle cellule che a livello extracellulare.
Lavare per rimuovere la paraffina, quindi reidratare il tessuto utilizzando concentrazioni di alcol decrescenti.
Riscaldare con un tampone acido per rompere i legami incrociati delle proteine indotte dalla formalina, smascherando gli epitopi antigenici sui batteri.
Incubare con cloruro di ammonio per neutralizzare i gruppi aldeidici reattivi residui formatisi durante la fissazione, prevenendo l'interazione aspecifica con gli anticorpi.
Trattare con un detergente per permeabilizzare le membrane cellulari, facilitando la penetrazione degli anticorpi.
Applicare una soluzione bloccante per prevenire il legame non specifico degli anticorpi.
Incubare con anticorpi primari che prendono di mira i microbi extracellulari e intracellulari.
Applicare anticorpi secondari coniugati con fluorofori che si legano agli anticorpi primari.
Aggiungi un colorante fluorescente legante il DNA per colorare i nuclei.
Trattare con un eliminatore di autofluorescenza per spegnere la fluorescenza da granuli intracellulari autofluorescenti, riducendo al minimo i segnali di fondo.
Utilizzando la microscopia a fluorescenza, esaminare il tessuto per confermare la presenza di microbi.