Rilevamento dell'alfa-sinucleina fosforilata mediante Western blotting

Iniziamo con le proteine del liquido cerebrospinale, tra cui l'alfa-sinucleina fosforilata, un biomarcatore delle malattie neurodegenerative.

Aggiungere un tampone di caricamento contenente un detergente, un agente riducente e un colorante tracciante.

Riscaldare per denaturare le proteine, quindi caricarle in un gel SDS-PAGE.

Eseguire l'elettroforesi per separare le proteine in base al peso molecolare in bande distinte.

Incubare il gel in un tampone assorbente agitandolo.

Quindi, trasferire elettro-le bande proteiche dal gel alla membrana.

Trattare la membrana con un fissativo per trattenere la proteina sulla membrana, quindi lavare.

Incubare con una soluzione bloccante contenente anticorpi primari e inibitori della fosfatasi per mantenere la fosforilazione dell'alfa-sinucleina.

Gli anticorpi interagiscono esclusivamente con l'alfa-sinucleina fosforilata e i reagenti bloccanti bloccano i siti di interazione aspecifici, quindi lavano.

Introdurre anticorpi secondari coniugati con enzimi che interagiscono con gli anticorpi primari, quindi lavare.

Aggiungere un substrato chemiluminescente, interagendo con gli enzimi e generando una chemiluminescenza.

Una banda chemiluminescente conferma la presenza di alfa-sinucleina fosforilata.