JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 1:22 min • March 4th, 2025
Prendi l'omogeneizzato di tessuto da un cervello di mammifero che contiene sia proteine prioniche normali che aggregati di prioni mal ripiegati responsabili di malattie neurodegenerative.
Incubare con un enzima proteolitico per digerire i prioni normali, lasciando intatti gli aggregati resistenti.
Trattare gli aggregati con un tampone denaturante ad alta temperatura per linearizzare le proteine e conferire una carica negativa uniforme.
Caricare il campione su un gel per elettroforesi e separare le proteine in bande, il che conferma la presenza di aggregati.
Utilizzando un campo elettrico, trasferire le proteine separate su una membrana.
Incubare la membrana in una soluzione bloccante per mascherare i siti di legame non specifici.
Incubare con anticorpi marcati con l'enzima perossidasi, che si legano specificamente agli aggregati prionici.
Lavare la membrana per rimuovere gli anticorpi non legati, riducendo al minimo i segnali aspecifici.
Aggiungere un substrato chemiluminescente e un agente ossidante, consentendo alla perossidasi di ossidare il substrato e produrre luce.
Misurare l'intensità della luce per quantificare i prioni mal ripiegati nell'omogeneizzato.