JoVE Encyclopedia of Experiments
Neuroscienze
0 visualizzazioni • 1:22 min • March 4th, 2025
Inizia con un tessuto cerebrale umano in un tampone di lisi.
Omogeneizzare il tessuto con un omogeneizzatore per rilasciare proteine, tra cui l'acido glutammico decarbossilasi o le isoforme dell'enzima GAD, essenziali per la funzione cerebrale.
Incubare l'omogeneizzato su ghiaccio, quindi centrifugare per pellettare i detriti. Raccogli il surnatante contenente proteine.
Aggiungere un tampone di caricamento contenente un detergente e un agente riducente per denaturare le proteine.
Caricare questo campione e un marcatore molecolare su un gel SDS-PAGE a gradiente ed elettroforese per separare le proteine in bande distinte.
Elettroblot le proteine dal gel su un foglio di membrana.
Aggiungere un agente bloccante per impedire l'associazione non specifica.
Incubare con anticorpi primari specifici per l'isoforma del GAD che si legano alle loro isoforme ricettive del GAD.
Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati.
Incubare con anticorpi secondari marcati in fluorescenza.
Lavare di nuovo e visualizzare le bande proteiche su un sistema di imaging.
Rilevare le bande GAD attraverso la fluorescenza e confermare le loro differenze di peso molecolare utilizzando il marcatore.