Name: Produzione ricombinante retrovirali e infezione delle cellule B (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-18T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Impara la produzione di retrovirus ricombinanti per esprimere geni di interesse nelle cellule B primarie. Questo metodo consente l'analisi efficiente della struttura e della funzione genica in immunologia.

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CK è supportato dal programma Columbia University Graduate. UB è Fellow della Leukemia and Lymphoma Society of America, il destinatario del Premio New Investigator dalla Fondazione per la Ricerca leucemia ed è supportato da Facoltà Columbia University di New start-up fondi.

1. Splenica B-linfociti isolamento e stimolazione <ol><li> Raccolta della milza di topi con deficit AID 12 tra 2-3 mesi di età. L'isolamento della milza viene eseguita in condizioni sterili e gli organi sono temporaneamente conservati in soluzione fisiologica fredda tampone fosfato (PBS) contenente 15% siero fetale bovino (FBS). </li><li> La milza è poi trasferito in una cappa sterile colture di tessuti e omogeneizzato in 5 ml di PBS integrata con il 2,5% FBS. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da 15 ml falco. </li><li> Centrifugare il campione omogeneizzato di tessuto splenico a 1000rpm per 10 minuti a 4 ° C per agglomerare le cellule. </li><li> Decantare il surnatante dopo centrifugazione. Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di globuli rossi (RBC) tampone di lisi a temperatura ambiente per 7 minuti per evitare la contaminazione da parte dei globuli rossi. </li><li> Centrifugare campione a 1000 rpm per 10 minuti e decantare il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di PBS contenente 2,5% FBS. </li><li> Rimuovere 100 microlitri aliquota e contare le cellule a una diluizione 1:1000 utilizzando un emocitometro standard utilizzando trypan blu per escludere qualsiasi cellule morte. Circa 20-30 milioni di cellule possono essere ottenuti per milza. </li><li> Centrifugare campione a 1000 rpm per 10 minuti e decantare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in 0,5% BSA / PBS contenente 2mM EDTA a una concentrazione di 10 7 cellule per 90 microlitri. </li><li> Aggiungi anticorpi anti-CD43 sfere magnetiche rivestito le cellule di legare specificamente cellule non-B. Usa 10 perle microlitri per 90 microlitri (10 7 cellule). Mescolare bene e incubare a 4 ° C per 20 minuti. </li><li> Una volta che le cellule sono stati etichettati, lavarli con l'aggiunta di 2,5% FBS / PBS alla parte superiore del tubo. Centrifugare campione a 1000 rpm per 10 minuti. </li><li> Decantare il surnatante. Risospendere le cellule in 0,1% BSA / PBS a una concentrazione di 10x10 7 celle per ml. </li><li> Montare una colonna magnetica ordinamento su un separatore magnetico. Posizionare un tubo conico direttamente sotto la colonna di raccogliere il flusso-through e caricare la colonna con 3 ml 0,5% BSA / PBS al primo e lavare. </li><li> Una volta che il liquido di lavaggio ha scorreva, sostituirlo con un tubo di nuova collezione. Se il campione è inferiore a 1 ml, regolare il volume campione ad 1 ml con 0,5% BSA / PBS / EDTA e caricare il campione nella colonna. Caricare solo un massimo di 1 ml di cellule per colonna e utilizzare più colonne, se necessario. </li><li> Permettono alle cellule di flusso passivamente attraverso la colonna e raccogliere le cellule non legato nel tubo conico sotto la colonna. Lavare la colonna 4 volte con 3 ml 0,5% BSA / PBS, pur continuando a raccogliere le flow-through. </li><li> Raccogliere tutte le flow-through, in cui le cellule CD43 negative B riposo sarà arricchita. Eliminare la colonna. Centrifuga flow-through a 1000 rpm per 10 minuti. </li><li> Scolate il surnatante e aggiungere 10 ml di mezzo (15% FCS / + glutammina, Pen / Strep, aminoacidi non essenziali, 50 mM Β-ME) </li><li> Contare le celle e la cultura a 10 6 cellule per ml. </li><li> Al fine di stimolare la crescita e la proliferazione delle cellule B, integrare il supporto con anticorpo IL-4 e anti-CD40 in modo tale che le concentrazioni finali sono 20 mg / ml e 1 mg / ml, rispettivamente, e trasferire le cellule in un pallone cultura. </li><li> Coltura delle cellule durante la notte. Contare le celle e diluire a 10 6 cellule per ml, l'aggiunta di IL-4 e CD40 a seconda dei casi. </li><li> Celle di coltura per 72 ore prima dell'infezione virale. </li></ol> 2. Trasfezione delle cellule Produttore Utilizzano i protocolli stabiliti per la trasfezione utilizzando lipidi cationici o fosfato di calcio. Trasfezione 10 centimetri 3 Piastra per costruire il DNA, utilizzando 100 mg di DNA plasmidico per piastra. Noi abitualmente uso di fosfato di calcio metodo di trasfezione 13, 14 e nota alto titolo virale quando è integrato con la clorochina. <ol><li> Usa il 60% -70% delle cellule confluenti Phoenix come cellule produttore per essere transfettate. A questo conta delle cellule confluenza dovrebbe essere di 5 milioni di cellule per 10 piastra cm. </li><li> Un'ora prima della transfezione, sostituire il supporto con freschi multimediale completa per la crescita cellulare Phoenix. </li><li> In una provetta sterile eppendorpf, unire 100 mg di imballaggio costruire DNA, 250 ml di 0,5 M CaCl 2, e regolare il volume finale a 500 microlitri di acqua sterile </li><li> Usando una pipetta da 1 ml, mescolare vigorosamente questa soluzione con 500 microlitri HNP 2X in un tubo di polipropilene 15 ml </li><li> Lasciare il composto a riposare a temperatura ambiente per 8-10 minuti. Durante questo periodo si forma un precipitato. </li><li> Aggiungere la miscela di trasfezione goccia a goccia per le cellule, mentre vorticose del mezzo per distribuire uniformemente il composto in tutto. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C per 12 ore. </li><li> 12 ore dopo la trasfezione, sostituire il supporto con 8ml completo mezzo di crescita delle cellule B e le cellule ritorno ai 37 ° C incubatore. </li></ol> 3. L'infezione di cellule stimolate B splenica <ol><li> Rimuovere il surnatante dalle cellule Phoenix 48 ore post-transfection e passare il sovranatante attraverso un filtro 0,2 micron per rimuovere i detriti. </li><li> Mescolare 3 mL di virus contenenti surnatante con 3 ml di pre-cellule B attivate (come al punto 1). Al fine di migliorare l'adsorbimento virale alle cellule, aggiungere polibrene ad una concentrazione finale di 16 mg per ml. </li><li> Infettare le cellule mediante centrifugazione a 2500 rpm per 90 minuti a 30 ° C. </li><li> Immediatamente dopo lo spin, incubare per ulteriori 48-72 ore a 37 ° C per consentire la crescita cellulare e la proliferazione. </li></ol> 4. Citometria a Flusso Analisi <ol><li> Utilizzando un citofluorimetro, analizzare le cellule per l'espressione superficiale di IgG1 B220 e superficie. La presenza di IgG1 sulla superficie delle cellule indica che l'interruttore di ricombinazione di classe si è verificato a seguito di salvataggio di successo attraverso la complementazione retrovirali del gene AID. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Abbiamo liberato con successo la carenza del fattore proteico citidina deaminasi indotta da attivazione (AID) da AID-deficienti (AID-/ -) linfociti B con trasduzione retrovirale. In breve, abbiamo generato retrovirus ricombinante esprimente SOCCORSO mouse (cameriera) proteina trasfezione delle cellule Phoenix con PMX-Maid-GFP 15-18. I virus raccolti sono stati infettati in AID-deficienti cellule B ottenute da AID topi con deficit di ricombinazione ex interruttore classe vivo (CSR) condizioni di stimolazione 19. Le cellule B infettate sono stati poi analizzati per la RSI a IgG1 dopo 72 ore di cultura in citometria a flusso di analisi. La figura 2 mostra la rilevazione di IgG1 sulla superficie delle cellule B con aiuti, ma non il costrutto vuoto, a indicare che la RSI si è verificato a seguito di aiuti al salvataggio espressione. <img src="/files/ftp_upload/2371/2371fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Schema di imballaggio retrovirale all'interno delle cellule produttore: Gene di interesse, rappresentate da Ψ, era subcloned in PMX-IRES-GFP, come descritto in precedenza 15. Il plasmide è stato transfettate in una linea cellulare di packaging ecotropic virale in grado di produrre gag-pol e proteine ​​busta (Phoenix, Orbigen), utilizzando il metodo di fosfato di calcio 13, 14. Quarantotto ore dopo la trasfezione, surnatante contenente particelle virali è stato raccolto per l'infezione in cellule B target primario ottenuti da topi. <img src="/files/ftp_upload/2371/2371fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: le cellule B SOCCORSO carenti, stimolati con anti-CD40 e IL-4 sono state infettate con un retrovirus contenente PMX-Maid-GFP o un retrovirus che esprime GFP solo. Il livello di CSR per IgG1 è stata valutata mediante analisi FACS.

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<li>Delphin, S., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+antibody+class+switching+to+IgE%3A+characterization+of+an+IL-4-responsive+region+in+the+immunoglobulin+heavy-chain+germline+epsilon+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter.</a> Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Trasduzione retrovirale delle cellule B della milza, come descritto qui e come illustrato nella figura 1 è un approccio genetico che è utile nello studio dei linfociti B, perché molti degli eventi di sviluppo in lymphopoesis sono controllati da regolazione trascrizionale 1, 2. Negli ultimi stadi di maturazione delle cellule B, innescando via CD40L è essenziale per l&#39;induzione della crescita delle cellule B, l&#39;ingresso nel ciclo cellulare e la proliferazione 11, 20. Come mos...

<table><tbody><tr><td>FCS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lisi dei globuli rossi (RBC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Microsferette CD43</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezzo completo per linfociti B</td><td>Varie</td><td>Componenti vari</td><td>RPMI, 15% FCS, 1% aminoacidi non essenziali, 1% piruvato di sodio, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50&amp;#x03BC;M &amp;#946;-mercapto&amp;#8211;etanolo</td></tr><tr><td>IL-4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD40</td><td>BD Biosciences</td><td>553787</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689 &amp;#8232;</td><td></td></tr><tr><td>Clorochina difosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628</td><td>Usata a 100 mM</td></tr><tr><td>Celle Ph&amp;#8211;nix Eco (murine)</td><td>Orbigen</td><td>RVC-10002</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5-&amp;alpha;-topo-CD45R (B220)</td><td>eBioscience</td><td>15-0452-81</td><td></td></tr><tr><td>PE-&amp;alpha;-topo-IgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>A85-1</td><td></td></tr></tbody></table>

produzione ricombinante retrovirali e infezione delle cellule b

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

L&#39;espressione transgenica di geni nelle cellule eucariotiche è un potente approccio inverso genetica in cui è espresso un gene di interesse sotto il controllo di un sistema di espressione eterologo per facilitare l&#39;analisi del fenotipo risultante. Questo approccio può essere utilizzato per esprimere un gene che non si trova normalmente nell&#39;organismo, per esprimere una forma mutante di un prodotto del gene, oppure a un eccesso di esprimere un dominante negativo forma del prodotto genico. E &#39;particolarmente utile nello studio del sistema ematopoietiche, dove regolazione trascrizionale è un meccanismo di controllo importante nello sviluppo e nella differenziazione delle cellule B 1, recensione in 2-4. Genetica del topo è un potente strumento per lo studio dei geni e delle patologie umane. Un&#39;analisi comparativa del mouse e genoma umano rivela conservazione delle synteny in oltre il 90% del genoma 5. Inoltre, gran parte della tecnologia utilizzata in modelli murini è applicabile allo studio dei geni umani, per esempio, le interruzioni dei geni e la sostituzione allelica 6 . Tuttavia, la creazione di un topo transgenico richiede una grande quantità di risorse sia di natura tecnica e finanziaria. Diversi progetti hanno cominciato a compilare le librerie di ceppi di topi knock out (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) o mutagenesi indotta da ceppi (RIKEN), che richiedono grandi sforzi e la collaborazione 7. Pertanto, è auspicabile primo studio il fenotipo di un gene desiderato in un modello di coltura cellulare di cellule primarie prima di passare a un modello murino. DNA retrovirale integra nel DNA ospite, preferibilmente all&#39;interno o in prossimità di unità di trascrizione o isole CpG, con conseguente stabile e ereditabile espressione del gene di interesse confezionato evitando silenziamento trascrizionale 8 9. I geni sono poi trascritti sotto il controllo di un promotore retrovirali ad alta efficienza, con una conseguente alta efficienza di trascrizione e produzione di proteine. Pertanto, l&#39;espressione retrovirali possono essere utilizzati con le cellule di difficile trasfezione, a condizione che le cellule sono in uno stato attivo durante la mitosi. Perché i geni strutturali del virus sono contenuti all&#39;interno della linea cellulare di packaging, i vettori di espressione utilizzata per clonare il gene di interesse non contengono geni strutturali del virus, che sia elimina la possibilità di revertanti virale e aumenta la sicurezza di lavorare con surnatanti virale come non virioni infettivi vengono prodotti 10. Qui vi presentiamo un protocollo per la produzione ricombinante retrovirali e successiva infezione delle cellule B della milza. Dopo l&#39;isolamento, le cellule coltivate splenica sono stimolati con Th linfochine derivati ​​e anti-CD40, che induce una raffica di proliferazione e differenziazione delle cellule B 11. Questo protocollo è l&#39;ideale per lo studio di eventi che si verificano in ritardo nello sviluppo delle cellule B e la differenziazione, le cellule B sono isolate dalla milza seguenti iniziale eventi ematopoietiche, ma prima di stimolazione antigenica per indurre la differenziazione plasmocitaria.

Un efficiente sistema di struttura e analisi funzionale di un gene in un<em&gt; Ex vivo</emCultura&gt; splenica di linfociti B è descritto. Questo metodo si avvale della produzione retrovirali ricombinanti in un libero helper, ecotrophic linea cellulare di packaging. Stabile, ereditari espressione di un gene di interesse all&#39;interno di linfociti primario è raggiunto porta alla generazione di anticorpi di superficie sulle cellule B in fase interruttore ricombinazione classe.

Produzione ricombinante retrovirali e infezione delle cellule B

L'espressione transgenica di geni in cellule eucariotiche è un potente approccio di genetica inversa in cui un gene di interesse viene espresso sotto il controllo...

L'obiettivo generale di questa procedura è esprimere in modo stabile e ereditabile un gene di interesse. In questo caso, il regolatore dello switch di classe A ID all'interno di linfociti B primari da topi carenti di questo gene: vengono isolate e purificate cellule B spleniche, quindi attivate mediante anti-CD40 e IL-4. Un costrutto che codifica per A ID viene trasfettato in una linea cellulare di imballaggio per produrre particelle virali contenenti il gene. Successivamente, le cellule B preattivate vengono infettate con il retrovirus ricombinante prodotto dalle cellule di imballaggio.Le cellule vengono quindi coltivate per ulteriori 47-72 ore per consentire crescita, proliferazione ed espressione del costrutto introdotto. Infine, le cellule vengono colorate e analizzate mediante citometria a flusso per la presenza di anticorpi di superficie derivanti da switch di classe. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i modelli murini, è che richiede molte meno risorse finanziarie e tecniche, pur fornendo un sistema efficiente per l'analisi strutturale e funzionale di un gene di interesse, utilizzando un'accurata tecnica asettica.Prelevare le milze d

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Immunologia e Infezioni

Questa tecnica mostra un modo efficace per preparare le scorte retrovirali replica difettoso codifica di un oncogene umano, e successivamente utilizzata per l'induzione di malattie mieloproliferative nel modello murino.

Produzione di replica-difettoso da Retrovirus trasfezione transiente di cellule 293T

Un metodo per preparare le cellule degli insetti e infettare con baculovirus per la produzione di ricombinante proteinand mCD1d generare tetrameri mCD1d.

Un metodo per la produzione di proteine ​​ricombinanti mCD1d in cellule di insetto.

Un rapido, protocollo semplice e conveniente per la generazione di donatore-derivati ​​multivirus specifici CTL (RCtl) per infusione a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche (HSCT) a rischio di sviluppare infezioni da CMV, EBV o Adv. Questo processo di fabbricazione è GMP e deve assicurare l'applicazione più ampia di cellule T immunoterapia al di là di centri specializzati.

Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

Fonte: Zjablovskaja, P., et al., Proliferazione e Differenziamento di Cellule Precursori Mieloidi Murine 32D/G-CSF-R. J. Vis. Exp. (2018)Questo video illustra la produzione di particelle retrovirali ricombinanti mediante trasfezione di cellule impacchettatrici derivate da rene umano, consentendo la consegna stabile di geni a cellule bersaglio per applicazioni successive come la modificazione genetica, saggi funzionali o studi sulla differenziazione linéaria.

Produzione di particelle retrovirali per il trasferimento genico

Descriviamo un protocollo per amplificare i siti di integrazione retrovirale dal DNA genomico delle cellule infette, sequenziare le giunzioni virus-ospite amplificate e quindi mappare queste sequenze su un genoma di riferimento. Descriviamo anche le tecniche per quantificare la distribuzione dei siti di integrazione rispetto a varie annotazioni genomiche utilizzando BEDTools.

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Qui si descrive un nuovo metodo per generare recettori delle cellule T antigene-specifiche (TCR) accoppiando la TCRα o TCRβ di un TCR esistente, che possiede l'antigene-specificità di interesse, con hemichain complementare del T periferico recettore delle cellule repertorio. I TCR de novo generati conservano antigene-specificità con vari affinità.

Generazione<em&gt; De Novo</em&gt; Antigene-specifici T umana recettori cellulari di trasduzione retrovirale di Centric Hemichain

Molti sistemi sperimentali sono stati utilizzati per comprendere i meccanismi che regolano lo sviluppo delle cellule T e la funzione in una risposta immunitaria. Qui un approccio genetico mediante trasduzione retrovirale è descritto, che è economica, tempo efficiente e, soprattutto, altamente informativo nell'identificare vie di regolazione.

Trasduzione retrovirale di cellule T helper come un approccio genetico per studiare meccanismi che controllano la loro differenziazione e funzione

In questo articolo, forniamo che un protocollo dettagliato per l'espressione di proteine di fusione fluorescenti nel midollo osseo murino derivate macrofagi e cellule dendritiche. Il metodo si basa sulla trasduzione del midollo osseo progenitrici con retrovirali seguite da differenziazione in macrofagi e dendritiche cellule in vitro.

Espressione di proteine di fusione fluorescenti in macrofagi e cellule dendritiche derivate da midollo osseo Murine

Illustreremo un protocollo di 9 giorni per la trasduzione e l'espansione delle cellule mononucleari periferiche del macaco rhesus che produce cellule con un'eccellente co-espressione dei geni di interesse in numero sufficiente per gli studi di infusione dell'efficacia cellulare.

Trasduzione ed espansione delle cellule T primarie in nove giorni con manutenzione del fenotipo della memoria centrale

Qui descriviamo un metodo per la sovraespressione retrovirale e il trasferimento adottivo di cellule murine B-1a per esaminare la migrazione e la localizzazione delle cellule B-1a in vivo. Questo protocollo può essere esteso per diversi saggi funzionali a valle, tra cui la quantificazione della localizzazione cellulare B-1a del donatore o l'analisi dei fattori seminati derivati dalla cellula donatrice durante il trasferimento post-adozione.

Sovraespressione retrovirale di CXCR4 su cellule Murine B-1a e trasferimento adottivo per migrazione mirata di cellule B-1a verso il midollo osseo e la produzione di IgM

Impara la produzione di retrovirus ricombinanti per esprimere geni di interesse nelle cellule B primarie. Questo metodo consente l'analisi efficiente della struttura e della funzione genica in immunologia.

Produzione ricombinante retrovirali e infezione delle cellule B

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