Decellularization e Recellularization di fegati interi
4 febbraio 2011
Decellularization perfusione è una tecnica innovativa per la produzione di ponteggi fegato intero che conserva la composizione della matrice extracellulare l'organo e la microarchitettura. Qui, il metodo di preparazione di ponteggi intero organo utilizzando decellularization perfusione e conseguente ripopolamento con epatociti è descritto. Trapianti di fegato funzionale e trapiantabili possono essere generati utilizzando questa tecnica.
L'obiettivo generale di questa procedura è preparare innesti epatici di dimensioni adeguate utilizzando la matrice epatica descellularizzata. Questo viene ottenuto innanzitutto cannulando un fegato donatore. L'organo viene quindi descellularizzato mediante perfusione con una serie di soluzioni detergenti.
La rivascolarizzazione della matrice epatica descelularizzata viene quindi eseguita introducendo epatociti primari adulti mediante perfusione. Infine, un sistema di perfusione in vitro viene utilizzato per coltivare l’innesto epatico cellularizzato. In definitiva, è possibile ottenere risultati che dimostrano la funzionalità epatica degli innesti rimodellati in vitro, misurando la secrezione di albumina, urea e acidi biliari totali nel mezzo di perfusione.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle metodiche esistenti, come la fabbricazione di scaffold mediante biomateriali sintetici e le tradizionali tecniche di ingegneria tissutale, è, a mio avviso, la presenza di una composizione della matrice extracellulare specifica per il tessuto. Lo scaffold descellularizzato mediante perfusione possiede inoltre una microarchitettura specifica per il tessuto, come la struttura vascolare. La presenza della struttura vascolare ci permette di reintrodurre le cellule nello scaffold in modo più uniforme.
Permette inoltre di perfonderlo in modo uniforme con nutrienti per migliorare la sopravvivenza cellulare. La parte relativa alla decelerazione del protocollo sarà dimostrata da Nima insieme al collega post-dottorato in strutturistica del nostro laboratorio. La parte sulla re-reticolizzazione sarà dimostrata da Gabriel Price, anch'egli ricercatore post-dottorato.
Il suo lavoro si concentra sull'industrializzazione di questi innesti. Per eseguire la decellularizzazione mediante perfusione, iniziare prelevando un fegato di ratto tramite cannulazione della vena porta. Utilizzando un catetere da 18 gauge, lasciare aperte la vena cava inferiore e superiore. Mantenere l'organo idratato in soluzione salina tamponata al fosfato o PBS in una piastra di Petri da 10 centimetri.
Successivamente, preparare un sistema di perfusione costituito da un serbatoio da otto litri, una pompa peristaltica e un trappola per bolle. Riempire il sistema di perfusione con soluzione salina tamponata al fosfato o PBS e mantenerlo in funzione per 10 minuti. Quindi riempire una piastra di Petri da 10 centimetri con PBS e ridurre la velocità di flusso del tampone a 1,2 millilitri al minuto.
Trasferire con attenzione il fegato raccolto nella piastra di Petri contenente PBS e lasciarlo perfondere durante la notte. Il giorno successivo, perfondere il fegato con 0,01% di sodio ESAL solfato o SDS in acqua distillata per cinque minuti.
Quindi tornare al PBS per un'ora. Ripetere i passaggi di perfusione con SDS e PBS altre tre volte, aumentando il tempo di perfusione con SDS a 10, 15 e infine 20 minuti. Successivamente, perfondere il fegato con la seguente serie: 0,01% SDS per 24 ore.
0,1% SDS per 24 ore. 0,2% SDS per tre ore, 0,5% SDS per tre ore. Acqua distillata per 15 minuti, 1% Triton X-100 in acqua distillata per 30 minuti, al fine di rimuovere eventuali acidi nucleici legati.
E infine, PBS per due ore, che laverà la matrice epatica descellularizzata o DLM dopo il completamento della perfusione, se desiderato; resecare tutti i lobi tranne il lobo mediano. Conservare la DLM in una piastra di Petri pulita e sigillata in PBS a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso per sterilizzare la DLM. Lavare con PBS sterile contenente 0,1% di acido peracetico e 4% di etanolo e incubare per tre ore a quattro gradi Celsius.
Successivamente, lavare il DLM due volte con PBS sterile. Quindi con PBS contenente 2% di penicillina-streptomicina, 10 microgrammi per millilitro di gentamicina e 2,5 microgrammi per millilitro di anfotericina B. Conservare il fegato descellularizzato nella stessa soluzione a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso per esperimenti di izzazione.
Due, cellularizzare una matrice epatica descelularizzata sotto una cappa per colture cellulari. Iniziare con un sistema di perfusione simile a quello utilizzato per descelularizzare il fegato. Riempire il sistema di perfusione con 200 millilitri di mezzo di coltura, come DMEM ad alto contenuto di glucosio, 10% di siero fetale bovino, 100 unità per millilitro di penicillina e 100 microgrammi per millilitro di streptomicina.
Posizionare il DLM nella camera di perfusione e collegarlo al sistema di perfusione attraverso la cannula della vena porta mentre la pompa funziona a cinque millilitri al minuto. Per evitare la formazione di bolle d'aria, lasciare che il mezzo perfonda il DLM per 30 minuti. Successivamente, arrestare il flusso nel sistema di perfusione e iniettare lentamente 50 milioni di epatociti isolati da un ratto adulto nel sistema di perfusione attraverso il trappolabolle.
Riavviare il flusso a 10 millilitri al minuto e ricircolare il mezzo per 10 minuti. Arrestare nuovamente il flusso del mezzo. Iniettare ulteriori 50 milioni di epatociti.
Riavviare quindi nuovamente il flusso a 10 millilitri al minuto. Ripetere questa procedura fino a quando un totale di 200 milioni di epatociti non sarà stato introdotto nel DLM. Una volta iniettate tutte le cellule nel DLM, raccogliere l'elevato flusso in provette centrifughe da 50 millilitri e centrifugare a 800 RPM per cinque minuti.
Eliminare i sovranatanti e unire i pellet in un singolo tubo. Determinare il numero di cellule e la loro vitalità mediante esclusione del blu di trian. Per stabilire l'efficienza di semina in coltura.
Cellularizzare un innesto epatico. Allestire un sistema di perfusione sterile che includa un ossigenatore. Riempire il sistema di perfusione con 50 millilitri di mezzo di coltura, come Williams E con 5%PBS, 0,5 unità per millilitro di insulina.
20 nanogrammi per millilitro di EGF, 14 nanogrammi per millilitro di glucagone, 7,5 microgrammi per millilitro di idrocortisone, 100 unità per millilitro di penicillina e 100 microgrammi per millilitro di streptomicina. Posizionare l'innesto epatico cellularizzato nella camera di perfusione e collegarlo al sistema di perfusione attraverso la cannula della vena porta mentre la pompa funziona a cinque millilitri al minuto.
Per evitare la formazione di bolle d'aria, chiudere in modo asettico la camera di perfusione e sigillarla accuratamente per prevenire qualsiasi perdita durante la coltura. Incubare il sistema di perfusione a 37 gradi Celsius con il 10% di anidride carbonica e aumentare la velocità di flusso della perfusione a 15 millilitri al minuto. Collegare l'ossigenatore a una bombola contenente una miscela gassosa al 95% di ossigeno e al 5% di anidride carbonica e impostare la velocità di flusso del gas a 0,5 litri al minuto.
Questo dovrebbe raggiungere una pressione parziale di ossigeno di circa 400 millimetri di mercurio. Continuare la coltura per un massimo di 10 giorni con cambi giornalieri del mezzo di coltura. Campionare il mezzo giornalmente per la secrezione di albumina, urea e acidi biliari totali al fine di monitorare le funzioni epatiche dell'innesto al termine del periodo di coltura.
Campionare l'innesto epatico cellularizzato per analisi molecolari e istologiche. La completa decellularizzazione di un fegato di ratto richiede circa 72 ore, utilizzando il protocollo descritto.
La matrice risultante mantiene il 100% del collagene fibrillare, il 50% dei glicoamino-glicani e soltanto il 5% del DNA del fegato nativo. La struttura vascolare della matrice è preservata, come dimostrato dall'analisi mediante modellatura per corrosione e microscopia elettronica a scansione. La presenza della microarchitettura vascolare all'interno della DLM ne facilita il ripopolamento cellulare con un'efficienza del 96% e la successiva perfusione.
Per la coltura in vitro, il trapianto epatico può essere coltivato fino a 10 giorni in vitro e mostra adeguate funzioni epatiche, confermate mediante la secrezione di albumina, urea e acidi biliari totali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come decellularizzare e ricellularizzare l'intero fegato.
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Panoramica
La decellularizzazione mediante perfusione è una tecnica utilizzata per creare impalcature di fegato intero che mantengono la composizione della matrice extracellulare e la microarchitettura dell'organo. Questo articolo descrive la preparazione di queste impalcature e il loro ripopolamento con epatociti per generare innesti epatici funzionali e trapiantabili.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Medicina Rigenerativa
- Ingegneria degli Organi
- Biologia Cellulare
Sfondo
- La decellularizzazione rimuove i componenti cellulari dagli organi.
- La conservazione della matrice extracellulare è fondamentale per la funzione dell'organo.
- Gli epatociti sono le principali cellule funzionali del fegato.
- I trapianti epatici funzionali sono essenziali per il trapianto.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per la creazione di impalcature epatiche.
- Ricolonizzare le impalcature con epatociti.
- Valutare la funzionalità degli innesti epatici risultanti.
Metodi Utilizzati
- Canulazione del fegato donatore per la perfusione.
- Decellularizzazione mediante soluzioni detergenti.
- Rivascolarizzazione mediante introduzione di epatociti primari adulti.
- Coltura in vitro dell'innesto epatico cellularizzato mediante un sistema di perfusione.
Risultati principali
- Decellularizzazione riuscita della matrice epatica.
- La ripopolazione con epatociti ha dimostrato la funzionalità epatica.
- La misurazione della secrezione di albumina, urea e acidi biliari ha confermato la funzionalità.
- Potenziale per la creazione di innesti epatici trapiantabili.
Conclusioni
- La decellularizzazione con perfusione è efficace per la preparazione di impalcature epatiche.
- La ripopolazione con epatociti può ripristinare la funzione epatica.
- Questo metodo mostra potenzialità per applicazioni nel trapianto d'organo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La decellularizzazione e la ricellularizzazione di fegati interi permettono la creazione di bioscaffolds specifici per organo che mantengono l'architettura nativa dei vasi sanguigni e della matrice extracellulare, affrontando un collo di bottiglia fondamentale nella medicina rigenerativa e nell'ingegneria degli organi. Questo approccio supporta un'elevata predittività nella ricostruzione di tessuti funzionali e fornisce una piattaforma per valutare le interazioni tra cellule e matrice rilevanti per lo sviluppo di modelli preclinici. Il metodo è strategicamente posizionato per influenzare la fase iniziale della scoperta, la ricerca traslazionale e l'evoluzione di portafogli con rischio calibrato nella R&D biofarmaceutica.
Applicazioni Strategiche nella Biofarmaceutica R&D
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi delle interazioni cellula-matrice in un impalcatura fisiologicamente rilevante.
- Supporta la riduzione del rischio biologico preservando la microarchitettura epatica nativa per studi funzionali.
- Facilita la valutazione predittiva della vitalità e della funzione degli epatociti in ambienti ingegnerizzati.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce scaffold validati e specifici per organo per la semina cellulare standardizzata e saggi funzionali.
- Consente la misurazione riproducibile di prodotti epatici come albumina, urea e acidi biliari.
- Supporta la scalabilità e il riutilizzo della piattaforma per la valutazione di composti in sistemi pertinenti al fegato.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alla modellizzazione rilevante per le malattie mantenendo la matrice extracellulare e le strutture vascolari native.
- Permette una continuità tra la validazione funzionale in vitro e gli studi di trapianto in vivo.
- Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio basate su letture funzionali quantitative.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dal test iniziale delle ipotesi fino alla validazione preclinica, fornendo un ponte tra modelli di tessuti ingegnerizzati e ricerca traslazionale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulle interazioni tra cellule e matrice e sulle interazioni vascolari in un ambiente simile al nativo.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili per la valutazione funzionale degli epatociti e degli innesti ingegnerizzati.
- Analisi: Permette la misurazione della secrezione di albumina, urea e acidi biliari per confrontare le prestazioni degli innesti.
- Ricerca traslazionale: Facilita la continuità preclinica consentendo la validazione funzionale in vitro e in vivo.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per i flussi di lavoro nell'ingegneria dei tessuti epatici e nella medicina rigenerativa.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella funzione del tessuto e nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione del supporto e la recellularizzazione per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e riduce i rischi biologici tardivi nei programmi di ingegneria degli organi.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione degli asset nella medicina rigenerativa e nelle terapie cellulari basata sull'adeguamento al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'irrorazione d'organo, nella decellularizzazione e nelle tecniche di coltura cellulare.
- Richiede sistemi di irrorazione specializzati e infrastrutture analitiche per ottenere letture funzionali.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi di lavoro per la preparazione del scaffold e i protocolli di recellularizzazione.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diverse specie o dimensioni d'organo in base ai requisiti del sistema modello.
- Le limitazioni includono la necessità di tessuto donatore di alta qualità e un controllo preciso dei parametri di irrorazione.
