Separazione delle frazioni di membrana interna ed esterna di batteri Gram-negativi

Inizia con la frazione totale di membrana di un batterio Gram-negativo, comprese le vescicole della membrana interna ed esterna, sospese in un saccarosio a bassa densità che preserva l'integrità strutturale.

Per separare le vescicole della membrana, aggiungere in sequenza soluzioni di saccarosio ad alta e media densità in una provetta per ultracentrifuga.

Quindi, aggiungi la frazione di membrana e il saccarosio a bassa densità per creare un gradiente di saccarosio discontinuo.

Ultracentrifuga per separare le vescicole in base alla loro densità.

Le vescicole della membrana interna meno dense formano uno strato nella parte superiore.

Le vescicole della membrana esterna più dense, ricche di lipopolisaccaridi e proteine, formano una banda all'interfaccia di soluzioni di saccarosio a media e alta densità.

Raccogliere lo strato interno della membrana e scartare la soluzione sfumata, lasciandone una piccola quantità.

Quindi, raccogli lo strato esterno della membrana.

Aggiungere un buffer di archiviazione a ogni frazione per la stabilizzazione.

Centrifugare per separare le vescicole e rimuovere il surnatante.

Risospendere le vescicole di membrana purificate, omogeneizzarle e conservarle a basse temp