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Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:16 min • August 29th, 2025
Il polifosfato inorganico (polyP) è un polimero fosfato lineare coinvolto nella virulenza batterica e nella risposta allo stress, immagazzinato sotto forma di granuli citoplasmatici.
Per quantificare il poliP, prelevare una piastra multipozzetto con concentrazioni crescenti di standard di fosfato inorganico.
Aggiungere l'estratto di poli P batterico purificato in un pozzetto vuoto.
Introdurre un tampone di reazione contenente l'enzima esopolifosfatasi in ciascun pozzetto e incubare.
L'enzima scinde il poliP in fosfato inorganico libero, convertendolo in una forma quantificabile.
Aggiungere un reagente di rilevamento contenente molibdato e acido ascorbico e incubare.
Il molibdato reagisce con il fosfato per formare complessi fosfomolibdati, che vengono ridotti dall'acido ascorbico in complessi di colore blu.
Misurare l'assorbanza del complesso colorato. L'assorbanza misurata corrisponde all'intensità del colore blu che è direttamente proporzionale alla concentrazione di fosfato.
Genera la curva standard e calcola i livelli di fosfato del campione, riflettendo il contenuto originale di poliP dei batteri.
Inizia preparando standard contenenti zero, cinque, 50 o 200 micromolari di fosfato di potassio in 50 millimolari di pH otto tris-cloridrato.
Aliquotare 100 microlitri di ogni standard di fosfato e 100 microlitri di campioni di poliP estratti in pozzetti separati di una piastra trasparente a 96 pozzetti. Preparare una miscela master contenente, per campione, 30 microlitri di tampone di reazione 5X ScPPX, 19 microlitri di acqua e un microlitro di ScPPX purificato. Aggiungere 50 microlitri della miscela master a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti.
E incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Il giorno del rilevamento, preparare una nuova scorta di soluzione di rilevazione mescolando a 9,12 millilitri di base della soluzione di rilevazione con 88 millilitri di acido ascorbico molare e lasciarla a temperatura ambiente prima dell'uso. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di rilevazione a ciascun campione e standard nella piastra a 96 pozzetti.
Per consentire lo sviluppo del colore, incubare la piastra a temperatura ambiente per circa due minuti. Utilizzare un lettore di piastre per misurare l'assorbanza a 882 nanometri e calcolare la concentrazione di fosfato di ciascun campione rispetto alla curva standard del fosfato di potassio. Quindi convertire le concentrazioni di fosfato in nanomoli di fosfato derivato da poliP in ciascun lisato cellulare e normalizzare il contenuto di poliP cellulare in proteina cellulare totale, come descritto nel manoscritto.