Un saggio per la quantificazione del polifosfato inorganico nei batteri
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:16 min. • August 29th, 2025
Il polifosfato inorganico (polyP) è un polimero fosfato lineare coinvolto nella virulenza batterica e nella risposta allo stress, immagazzinato sotto forma di granuli citoplasmatici.
Per quantificare il poliP, prelevare una piastra multipozzetto con concentrazioni crescenti di standard di fosfato inorganico.
Aggiungere l'estratto di poli P batterico purificato in un pozzetto vuoto.
Introdurre un tampone di reazione contenente l'enzima esopolifosfatasi in ciascun pozzetto e incubare.
L'enzima scinde il poliP in fosfato inorganico libero, convertendolo in una forma quantificabile.
Aggiungere un reagente di rilevamento contenente molibdato e acido ascorbico e incubare.
Il molibdato reagisce con il fosfato per formare complessi fosfomolibdati, che vengono ridotti dall'acido ascorbico in complessi di colore blu.
Misurare l'assorbanza del complesso colorato. L'assorbanza misurata corrisponde all'intensità del colore blu che è direttamente proporzionale alla concentrazione di fosfato.
Genera la curva standard e calcola i livelli di fosfato del campione, riflettendo il contenuto originale di poliP dei batteri.
Inizia preparando standard contenenti zero, cinque, 50 o 200 micromolari di fosfato di po
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