Saggio della replicazione di Legionella pneumophila nei macrofagi pretrattati con vescicole della membrana esterna

Iniziare con una piastra a più pozzetti contenente macrofagi pretrattati esposti alle vescicole della membrana esterna batterica della Legionella pneumophila, o OMV.

Aggiungere Legionella pneumophila a un rapporto batterio-cellula ospite definito per infettare i macrofagi trattati con OMV.

Durante l'incubazione, i macrofagi internalizzano i batteri all'interno dei fagosomi legati alla membrana.

Il pretrattamento con OMV altera la segnalazione dei macrofagi, inibendo la maturazione dei fagosomi.

Ciò facilita la formazione di un vacuolo contenente Legionella, che protegge i batteri e ne consente la replicazione intracellulare.

Aggiungere un detergente e incubare per lisare i macrofagi. Questo rilascia i batteri intracellulari nel mezzo.

Strisciare il lisato diluito su una piastra di agar arricchita di sostanze nutritive.

Durante l'incubazione, i batteri crescono e formano colonie visibili.

Conta le colonie per determinare le unità formanti colonie, o CFU, che rappresentano il numero di batteri vitali.

Confrontare i conteggi delle CFU tra macrofagi trattati con OMV e non trattati.

Una CFU più elevata nei macrofagi trattati con OMV rispetto a quelli non trattati indica che gli OMV facilitano la sopravvivenza della Legionella all'interno dei macrofagi.

Infettare cellule THP-1 pretrattate o non trattate con nucleo B del ceppo di L.pneumophila wild-type o cellule BMDM murine con un mutante privo di flagelli di questo ceppo senza cambiare il terreno dalle cellule.

Aggiungere batteri a un MOI di 0,5 che equivale a una volta 10 al quinto L.pneumophila per pozzetto. Incubare le colture rispettivamente per 24 e 48 ore. Per lisare le cellule, aggiungere saponina a una concentrazione finale dello 0,1% e incubare le cellule per cinque minuti.

Quindi strisciare 50 microlitri delle diluizioni necessarie su piastre di agar BCYE e incubare le piastre per tre giorni.

Conta visivamente le colonie formate a occhio ed esegui calcoli secondo il protocollo di testo.