JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:12 min • August 29th, 2025
Prendi una coltura di Staphylococcus aureus, un batterio con una spessa parete cellulare di peptidoglicano.
Diluire la coltura in terreno fresco contenente antibiotici e incubarla a una temperatura calda agitandola per favorire la crescita batterica.
Trasferire la coltura in una provetta e centrifugarla per pellettare i batteri.
Scartare il surnatante e posizionare il pellet sul ghiaccio per proteggere i batteri dai danni.
Risospendere il pellet nel tampone di lisi e trasferirlo in un tubo contenente perle di silice.
Inserire la provetta in uno strumento meccanico di lisi cellulare e avviare l'agitazione.
Le collisioni rapide tra i batteri e le perle generano forze di taglio. Questo lisa i batteri, rilasciando DNA, RNA e complessi RNA-proteina.
Gli ioni nel tampone di lisi stabilizzano le strutture dell'RNA, mentre gli agenti riducenti nel tampone inattivano gli enzimi che degradano l'RNA.
Ora, centrifugare nuovamente la miscela per pellettare i detriti.
Raccogliere il surnatante contenente acidi nucleici e proteine per ulteriori analisi.
Coltiva una colonia di ceppi che trasportano l'sRNA pCN51 P3 MS2 o i plasmidi pCN51 P3 MS2 in tre millilitri di terreno BHI integrato con 10 microgrammi per microlitro di eritromicina in duplicati.
Diluire ogni coltura notturna in 50 millilitri di terreno BHI fresco integrato con eritromicina per raggiungere un OD 600 di 0,05. Coltiva le colture a 37 gradi Celsius con agitazione a 180 giri/min per sei ore. Trasferire ogni coltura in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e centrifugare le provette a 2.900 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius, quindi scartare il surnatante, congelarlo e conservarlo a meno 80 gradi Celsius o mantenere i pellet sul ghiaccio ed eseguire direttamente la lisi meccanica cellulare.
Per eseguire la lisi cellulare meccanica, risospendere i pellet in cinque millilitri di tampone A e trasferire le cellule risospese in provette da centrifuga da 15 millilitri con 3,5 grammi di perle di silice. Inserire le provette in uno strumento meccanico di lisi cellulare ed eseguire un ciclo di 40 secondi a quattro metri al secondo. Centrifugare le provette a 2.900 volte G per 15 minuti, quindi recuperare il surnatante e tenerlo in ghiaccio.
Assicurarsi che il surnatante sia limpido, ripetendo la centrifugazione in caso contrario.