Isolamento di piccoli RNA bersaglio batterici regolatori legati all'RNA mediante purificazione per affinità

Prendi un lisato cellulare batterico contenente componenti cellulari, incluso l'sRNA marcato con MS2 legato al suo RNA bersaglio.

L'sRNA marcato con MS2 è un piccolo RNA regolatorio ingegnerizzato che trasporta un ansa dello stelo dell'aptamero MS2 alla sua estremità 5', che mostra un'elevata affinità per la proteina del rivestimento virale MS2.

Trasferire il lisato batterico in una colonna cromatografica di affinità pre-equilibrata contenente resina di amilosio legata a proteine di fusione composte da proteina legante il maltosio (MBP) e dalla proteina di rivestimento MS2.

La proteina del rivestimento MS2 immobilizzata cattura specificamente l'ansa dello sRNA marcato con MS2, mantenendo intatto l'sRNA legato all'RNA bersaglio

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Le molecole non marcate che rimangono non legate vengono raccolte nel flusso.

Lavare la colonna con tampone per rimuovere le molecole residue non legate.

Eluire con un tampone contenente maltosio, che sposta MBP dalla resina, rilasciando l'sRNA marcato con MS2 legato al suo RNA bersaglio.

Raccogli e conserva le frazioni su ghiaccio per preservare l'integrità dell'RNA per l'analisi a valle.

Rimuovere la punta della colonna, quindi mettere una colonna per cromatografia in un rack per colonne e lavare la colonna con acqua ultrapura. Aggiungere 300 microlitri di resina di amilosio e lavare la colonna con 10 millilitri di tampone A.Diluire 1, 200 picamoli di proteina MBP-MS2 in sei millilitri di tampone A e caricarlo nella colonna.

Lavare la colonna con 10 millilitri di tampone A.Successivamente, eseguire la purificazione di affinità MS2. Caricare il lisato di cellule nella colonna e raccogliere la frazione di flusso in una provetta di raccolta pulita. Lavare la colonna tre volte con 10 millilitri di tampone A e raccogliere la frazione di lavaggio, quindi eluire la colonna con un millilitro di tampone E e raccogliere la frazione di eluizione in una microprovetta da due millilitri.

Conservare tutte le frazioni raccolte sul ghiaccio fino all'estrazione dell'RNA.