Un metodo di microdiluizione in brodo per i test di suscettibilità agli antibiotici dei batteri Gram-positivi

Isolare le colonie batteriche Gram-positive da una piastra di coltura e sospenderle in un terreno.

Diluire la sospensione per ottenere la concentrazione batterica ottimale per il test.

Inoculare i pozzetti di prova di una micropiastra contenente concentrazioni crescenti di un antibiotico lipoglicopeptidico e di un pozzetto di controllo della crescita contenente solo il terreno.

Distribuire un'aliquota dal pozzetto di controllo sulle piastre di coltura per verificare la purezza della coltura e la conta batterica.

Incubare per consentire la crescita batterica, durante la quale viene sintetizzata la parete cellulare.

L'antibiotico si lega al peptidoglicano, un componente della parete cellulare, e ai suoi precursori, inibendo la polimerizzazione e indebolendo la parete.

L'interruzione consente alla pressione osmotica di causare la lisi cellulare.

Dopo l'incubazione, confermare la purezza della coltura e la conta batterica ottimale.

Ispezionare i pozzetti per la crescita batterica.

Il pozzetto di controllo mostra una crescita visibile, mentre il pozzetto del test con la più bassa concentrazione di antibiotico che inibisce completamente la crescita indica la concentrazione inibitoria minima (MIC).

In questa dimostrazione, verrà inoculata una piastra appena preparata. Per preparare l'inoculo, selezionare diverse colonie ben isolate da un agar sanguigno da 18 a 24 ore o da un'altra piastra di agar non selettiva. Qui vengono utilizzati i ceppi di controllo qualità di S. aureus ed E. faecalis.

Toccare la parte superiore di ogni colonia con un tampone sterile e trasferirne un po' in una provetta contenente da uno a cinque millilitri di CAMHB o soluzione fisiologica. Continuare a trasferire fino a quando la torbidità non corrisponde a uno standard di McFarland di 0,5 entro 15-30 minuti dalla preparazione, diluire l'inoculo da uno a 100 in CAMHB per arrivare a una concentrazione finale di cinque volte da 10 a quinta CFU per millilitro. L'intervallo accettabile è compreso tra due e otto volte 10 e il quinto CFU per millilitro.

Utilizzando immediatamente una pipetta multicanale con puntali sterili, trasferire 50 microlitri dell'inoculo finale in ciascun pozzetto appropriato della piastra del pannello MIC. Qui, quattro file vengono inoculate con ciascuno dei due isolati per un totale di quattro repliche per isolato. Successivamente, per eseguire un controllo della purezza, utilizzare una pipetta per trasferire da uno a 10 microlitri della soluzione nel controllo positivo della crescita in un agar non selettivo, come l'agar di soia tripticasi con il 5% di sangue di pecora.

Utilizzare un anello sterile per distribuire la soluzione sulla superficie della piastra. Ruotare la piastra di 90 gradi e strisciare di nuovo per assicurarsi che l'inoculo sia distribuito uniformemente. Coprite il piatto e mettetelo da parte.

In preparazione per una conta delle colonie, utilizzare una pipetta a canale singolo per trasferire 10 microlitri di soluzione nel pozzetto di controllo della crescita a 10 millilitri di miscela salina, quindi trasferire 100 microlitri in un terreno di agar non selettivo adatto, come l'agar di soia tripticasi con il 5% di sangue di pecora utilizzando un circuito sterile, distribuire la soluzione su tutta la superficie dell'agar. Ripetere questo processo due volte in direzioni diverse per garantire una distribuzione uniforme dell'inoculo. Quindi, impila fino a quattro pannelli MIC in un contenitore di plastica assicurandoti che il pannello superiore sia ben sigillato con un coperchio.

Quindi posizionare un tovagliolo di carta umido all'interno del contenitore di plastica e chiuderlo saldamente con il coperchio entro 30 minuti dall'inoculazione. Incubare i pannelli MIC, la piastra per il conteggio delle colonie e la piastra per il controllo della purezza in un incubatore ad aria ambiente a 35 gradi Celsius più o meno per 16-20 ore. Il giorno successivo, leggere la concentrazione inibitoria minima come la concentrazione più bassa che inibisce completamente la crescita batterica nei pozzetti rilevata ad occhio nudo.

Determina il numero di colonie sulla targhetta di conteggio delle colonie. Moltiplicare il numero contato per il fattore di diluizione. Ad esempio, 50 colonie moltiplicate per un fattore di diluizione di 10.000 equivalgono a cinque volte 10 per la quinta CFU per millilitro.

Un intervallo accettabile è compreso tra 20 e 80 colonie, che equivale a due o otto volte 10 per la quinta unità formante colonie per ml. La concentrazione dell'inoculo è una variabile importante per controllare il test di suscettibilità al fine di ottenere risultati accurati. Infine, controlla la targhetta di purezza.

Se tutte le colonie sono simili alle colonie usate come inoculo, allora può essere considerato puro. Se sono presenti altre colonie, è possibile che sia presente un contaminante nel pannello MIC e il test deve essere ripetuto.