Coltura di Mycobacterium tuberculosis in condizioni di restrizione del ferro

Inizia con una piastra di agar contenente colonie di Mycobacterium tuberculosis coltivate su un terreno arricchito di sostanze nutritive.

Inoculare una singola colonia in un brodo integrato con sostanze nutritive e incubare con agitazione per una crescita uniforme.

Consentire alla coltura di raggiungere la fase logaritmica tardiva, in cui le cellule sono metabolicamente attive.

Pipettare un piccolo volume su una piastra di agar arricchita, distribuirla uniformemente e incubare fino a formare uno strato batterico continuo.

Inumidire un tampone sterile con un terreno minimo a basso contenuto di ferro (LIMM) e raccogliere i batteri.

Sospenderli in un contenitore di plastica contenente LIMM per evitare la contaminazione da ferro.

Aggiungere un agente disperdente per evitare la formazione di grumi e incubare senza agitare.

In condizioni limitanti il ferro, i batteri attivano le risposte allo stress e producono siderofori nel citoplasma.

Questi vengono impacchettati in vescicole extracellulari e rilasciati nell'ambiente circostante.

I siderofori catturano il ferro e aiutano i batteri a sopravvivere.

Questo sistema evidenzia l'adattamento micobatterico e la sopravvivenza in condizioni di ferro limitato

Inoculare una singola colonia di MTB in due millilitri di brodo micobatterico integrato con arricchimento ADN. Incubare con agitazione a 37 gradi Celsius. Quando c'è una crescita visibile, estrarre due millilitri di coltura e misurare l'OD 540 su uno spettrofotometro.

Interrompere l'incubazione quando l'OD 540 raggiunge 0,8, il che indica la fase logaritmica tardiva. Distribuire 200 microlitri di coltura logaritmica tardiva sulle piastre di agar micobatteriche integrate con 0,2 glicerolo, 0,5% Tween 80 e ADN. Inoculare almeno cinque piastre.

Incubare le piastre a 37 gradi Celsius. E dopo una settimana, la crescita batterica è visibile come uno strato confluente. Quindi bagnare un batuffolo di cotone sterile in un mezzo a basso contenuto di ferro e minimo.

Usa questo tampone per raccogliere i batteri dalle piastre di agar. Inoculare i batteri in 100 millilitri di terreno a basso contenuto di ferro in una provetta. Raccogli una quantità sufficiente di batteri per preparare una sospensione con un OD 540 di uno.

Diluire la sospensione 10 volte a un litro con un mezzo minimo a basso contenuto di ferro e dividerla in due bottiglie di plastica sterili. Quindi, trasferisci due millilitri di coltura in una provetta da cinque millilitri. Aggiungere 10 microlitri di tiloxapol al 10% in volume in volume.

Incubare le colture a 37 gradi Celsius per 14 giorni.