Isolamento di vescicole extracellulari contenenti siderofori da Mycobacterium tuberculosis

0 visualizzazioni3:46 min • September 26th, 2025

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Prendi una coltura di Mycobacterium tuberculosis coltivata in un terreno limitante il ferro per migliorare la secrezione di vescicole extracellulari contenenti siderofori, un chelante del ferro.

Centrifuga per pellettare i batteri.

Raccogli il surnatante e filtralo per rimuovere i batteri residui.

Trasferire il filtrato in un sistema di ultrafiltrazione agitato e filtrare per rimuovere i mezzi in eccesso e concentrare le vescicole extracellulari.

Centrifugare il concentrato per pellettare i detriti cellulari.

Trasferire il surnatante in una provetta da ultracentrifuga e centrifugare per raccogliere il pellet EV.

Scartare il surnatante, risospendere il pellet in un tampone e mescolarlo con un mezzo a gradiente di densità concentrato per formare lo strato inferiore.

Sovrapporre con concentrazioni decrescenti del mezzo gradiente per creare un gradiente di densità discontinuo.

Aggiungere il tampone nella parte superiore e centrifugare. Le EV migrano verso lo strato che corrisponde alla loro densità di galleggiamento.

Raccogli ogni frazione in una provetta separata.

La frazione purificata con vescicole extracellulari contenenti siderofori è pronta per gli studi a valle.

Trasferire la coltura in cinque provette da centrifuga coniche da 225 millilitri e centrifugare a 2.850 volte g per sette minuti a 20 gradi Celsius. Raccogliere il surnatante di coltura con una pipetta da 50 millilitri e sterilizzarlo con un filtro da 0,22 micron.

Per isolare i MEV, trasferire il filtrato di coltura in un sistema di ultrafiltrazione a cellule agitate posizionato a quattro gradi Celsius e filtrare il concentrato a una pressione inferiore a 50 PSI attraverso una membrana di taglio da 100 kilodalton. Quindi centrifugare il filtrato di coltura concentrato a 15.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il surnatante in provette di ultracentrifugazione in policarbonato. Centrifugare il surnatante a 100.000 volte g per due ore a quattro gradi Celsius.

Successivamente, rimuovere il surnatante e risospendere i pellet membranosi in un totale di un millilitro di PBS sterile mediante pipettaggio delicato. Mescolare 0,5 millilitri della sospensione di pellet con 1,5 millilitri di soluzione di iodixanolo al 60% sul fondo di una provetta per ultracentrifuga in polipropilene a parete sottile. Sovrapponi questa sospensione di MEV iodixanolo al 45% con un millilitro di soluzioni di iodixanolo al 40%, 35%, 30%, 25% e 20% e un millilitro di PBS nella parte superiore.

Centrifugare a 100.000 volte g per 18 ore a quattro gradi Celsius. Quindi, utilizzare una siringa Hamilton da un millilitro per raccogliere le frazioni del gradiente di densità da un millilitro partendo dall'alto. Diluire ogni frazione raccolta a 20 millilitri con PBS e centrifugare a 100.000 volte g per due ore a quattro gradi Celsius.

Rimuovere il surnatante e risospendere in 0,5 millilitri di PBS.

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Ultimo aggiornamento: 1 agosto 2026