Isolamento di vescicole extracellulari contenenti siderofori da Mycobacterium tuberculosis
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:46 min • September 26th, 2025
Prendi una coltura di Mycobacterium tuberculosis coltivata in un terreno limitante il ferro per migliorare la secrezione di vescicole extracellulari contenenti siderofori, un chelante del ferro.
Centrifuga per pellettare i batteri.
Raccogli il surnatante e filtralo per rimuovere i batteri residui.
Trasferire il filtrato in un sistema di ultrafiltrazione agitato e filtrare per rimuovere i mezzi in eccesso e concentrare le vescicole extracellulari.
Centrifugare il concentrato per pellettare i detriti cellulari.
Trasferire il surnatante in una provetta da ultracentrifuga e centrifugare per raccogliere il pellet EV.
Scartare il surnatante, risospendere il pellet in un tampone e mescolarlo con un mezzo a gradiente di densità concentrato per formare lo strato inferiore.
Sovrapporre con concentrazioni decrescenti del mezzo gradiente per creare un gradiente di densità discontinuo.
Aggiungere il tampone nella parte superiore e centrifugare. Le EV migrano verso lo strato che corrisponde alla loro densità di galleggiamento.
Raccogli ogni frazione in una provetta separata.
La frazione purificata con vescicole extracellulari contenenti siderofori è pronta per gli studi a valle.
Trasferire la coltura in cinque provette da centrifuga coniche da 225 millilitri e centrifugare a 2.850 volte g per sette minuti a 20 gradi Celsius. Raccogliere il surnatante di coltura con una pipetta da 50 millilitri e sterilizzarlo con un filtro da 0,22 micron.
Per isolare i MEV, trasferire il filtrato di coltura in un sistema di ultrafiltrazione a cellule agitate posizionato a quattro gradi Celsius e filtrare il concentrato a una pressione inferiore a 50 PSI attraverso una membrana di taglio da 100 kilodalton. Quindi centrifugare il filtrato di coltura concentrato a 15.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il surnatante in provette di ultracentrifugazione in policarbonato. Centrifugare il surnatante a 100.000 volte g per due ore a quattro gradi Celsius.
Successivamente, rimuovere il surnatante e risospendere i pellet membranosi in un totale di un millilitro di PBS sterile mediante pipettaggio delicato. Mescolare 0,5 millilitri della sospensione di pellet con 1,5 millilitri di soluzione di iodixanolo al 60% sul fondo di una provetta per ultracentrifuga in polipropilene a parete sottile. Sovrapponi questa sospensione di MEV iodixanolo al 45% con un millilitro di soluzioni di iodixanolo al 40%, 35%, 30%, 25% e 20% e un millilitro di PBS nella parte superiore.
Centrifugare a 100.000 volte g per 18 ore a quattro gradi Celsius. Quindi, utilizzare una siringa Hamilton da un millilitro per raccogliere le frazioni del gradiente di densità da un millilitro partendo dall'alto. Diluire ogni frazione raccolta a 20 millilitri con PBS e centrifugare a 100.000 volte g per due ore a quattro gradi Celsius.
Rimuovere il surnatante e risospendere in 0,5 millilitri di PBS.
Panoramica
In questo articolo viene descritto un metodo per isolare vescicole extracellulari (EV) da colture di Mycobacterium tuberculosis cresciute in condizioni di limitazione del ferro. Il processo potenzia la secrezione di vescicole contenenti siderofori, importanti per studi successivi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Biologia cellulare
- Chimica biologica
Sfondo
- Mycobacterium tuberculosis è un patogeno significativo.
- Le vescicole extracellulari svolgono un ruolo nella comunicazione intercellulare.
- Gli siderofori sono fondamentali per l'acquisizione del ferro nei batteri.
- L'isolamento delle EV può fornire informazioni sulla fisiologia batterica.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per l'isolamento di EV da Mycobacterium tuberculosis.
- Potenziare il rendimento di EV contenenti siderofori.
- Preparare EV purificati per ulteriori analisi.
Metodi Utilizzati
- Centrifugazione per formare un pellet di batteri e raccogliere il sopranatante.
- Ultrafiltrazione per concentrare le EV e rimuovere il mezzo in eccesso.
- Centrifugazione su gradiente di densità per separare le EV in base alla densità galleggiante.
- Risospensione e ulteriore purificazione delle EV in tampone.
Risultati principali
- Isolati con successo EV contenenti siderofori da colture.
- Stabilito un metodo riproducibile per la purificazione degli EV.
- Dimostrata l'efficacia della centrifugazione su gradiente di densità.
- Fornito un protocollo per studi successivi sugli EV.
Conclusioni
- Il metodo consente un'efficiente isolazione di vescicole extracellulari da Mycobacterium tuberculosis.
- Le vescicole isolate possono essere utilizzate per ulteriori ricerche sull'acquisizione batterica del ferro.
- Questo protocollo può essere adattato ad altre specie batteriche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento di vescicole extracellulari (EV) contenenti siderofori da Mycobacterium tuberculosis in condizioni di limitazione del ferro permette un'analisi meccanicistica dell'acquisizione batterica del ferro e della comunicazione mediata da vescicole. Questo flusso di lavoro supporta una valutazione predittiva affidabile della validazione precoce dei bersagli e orienta la ricerca traslazionale sulle interazioni ospite-patogeno. La riproducibilità del protocollo e i suoi risultati quantitativi lo posizionano come una capacità riutilizzabile all'interno dei percorsi di scoperta in biotecnologia farmaceutica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente l'analisi funzionale dei percorsi di acquisizione del ferro nei batteri mediante EV contenenti siderofori.
- Supporta la riduzione del rischio biologico isolando le vescicole in condizioni di limitazione del ferro che imitano l'ambiente dell'ospite.
- Facilita la previsione attendibile della validazione degli obiettivi per strategie antitubercolari.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce preparazioni standardizzate e purificate di EV per saggi quantitativi successivi.
- Garantisce riproducibilità attraverso passaggi definiti di ultrafiltrazione e gradiente di densità.
- Permette una valutazione affidabile di composti che agiscono su processi mediati da vescicole.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per la malattia imitando la limitazione del ferro da parte dell'ospite durante l'isolamento degli EV.
- Supporta la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica di biomarcatori associati alle vescicole.
- Facilita decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio per portafogli di agenti anti-infettivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo l'isolamento di EVs funzionalmente rilevanti per studi meccanicistici e lo sviluppo di saggi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui meccanismi di acquisizione del ferro e di secrezione delle vescicole.
- Screening: Fornisce frazioni di EV pronte per saggi e riproducibili per la valutazione di composti.
- Analisi: Permette la frazionamento quantitativo e la misurazione di siderofori associati alle EV.
- Ricerca traslazionale: Collega la biologia delle vescicole alle interazioni ospite-patogeno rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo standardizzato adattabile a diversi modelli batterici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Consente l'isolamento standardizzato, scalabile e riproducibile di vescicole extracellulari (EV).
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza nell'uso del capitale nella scoperta di agenti anti-infettivi.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei programmi mirati alle vescicole extracellulari in base al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura batterica in condizioni di limitazione del ferro.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture per ultrafiltrazione e ultracentrifugazione.
- Richiede una standardizzazione tra gruppi di lavoro per l'isolamento riproducibile di EV.
- Adattabile ad altri sistemi batterici con ottimizzazione del protocollo.
- Dipende dalla preparazione precisa del gradiente di densità e dalla frazionatura.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Purificazione dei preparati vescicoli extracellulari ad alto rendimento lontano dal virus
Video correlati
0 Visualizzazioni
Cromatografia ad esclusione dimensionale per separare le vescicole extracellulari dai terreni di coltura cellulare condizionati
Video correlati
0 Visualizzazioni
Identificazione di peptidi di piccole vescicole extracellulari da macrofagi derivati dal midollo osseo
Video correlati
0 Visualizzazioni
Coltura di Mycobacterium tuberculosis in condizioni di restrizione del ferro
Video correlati
0 Visualizzazioni
Isolation of Phagosomes Containing Magnetic Bead-Tagged Bacteria from Infected Macrophages
Video correlati
0 Visualizzazioni
Concentrazione di proteine filtrate per colture batteriche utilizzando un dispositivo di ultrafiltrazione
Video correlati
0 Visualizzazioni
Una tecnica di cromatografia ad esclusione dimensionale per purificare le vescicole extracellulari micobatteriche
Video correlati
0 Visualizzazioni
Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi
Video correlati
0 Visualizzazioni
Isolamento e caratterizzazione delle vescicoli extracellulari prodotti da micobatteri a limite di ferro
Video correlati
0 Visualizzazioni
Mycobacterium tuberculosis Arricchimento delle vescicole extracellulari attraverso la cromatografia di esclusione dimensionale
Video correlati
0 Visualizzazioni
Ultimo aggiornamento: 29 agosto 2026