$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Prendi una coltura di Mycobacterium tuberculosis coltivata in un terreno limitante il ferro per migliorare la secrezione di vescicole extracellulari contenenti siderofori, un chelante del ferro.
Centrifuga per pellettare i batteri.
Raccogli il surnatante e filtralo per rimuovere i batteri residui.
Trasferire il filtrato in un sistema di ultrafiltrazione agitato e filtrare per rimuovere i mezzi in eccesso e concentrare le vescicole extracellulari.
Centrifugare il concentrato per pellettare i detriti cellulari.
Trasferire il surnatante in una provetta da ultracentrifuga e centrifugare per raccogliere il pellet EV.
Scartare il surnatante, risospendere il pellet in un tampone e mescolarlo con un mezzo a gradiente di densità concentrato per formare lo strato inferiore.
Sovrapporre con concentrazioni decrescenti del mezzo gradiente per creare un gradiente di densità discontinuo.
Aggiungere il tampone nella parte superiore e centrifugare. Le EV migrano verso lo strato che corrisponde alla loro densità di galleggiamento.
Raccogli ogni frazione in una provetta separata.
La frazione purificata con vescicole extracellulari contenenti siderofori è pronta per gli studi a valle.
Trasferire la coltura in cinque provette da centrifuga coniche da 225 millilitri e centrifugare a 2.850 volte g per sette minuti a 20 gradi Celsius. Raccogliere il surnatante di coltura con una pipetta da 50 millilitri e sterilizzarlo con un filtro da 0,22 micron.
Per isolare i MEV, trasferire il filtrato di coltura in un sistema di ultrafiltrazione a cellule agitate posizionato a quattro gradi Celsius e filtrare il concentrato a una pressione inferiore a 50 PSI attraverso una membrana di taglio da 100 kilodalton. Quindi centrifugare il filtrato di coltura concentrato a 15.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il surnatante in provette di ultracentrifugazione in policarbonato. Centrifugare il surnatante a 100.000 volte g per due ore a quattro gradi Celsius.
Successivamente, rimuovere il surnatante e risospendere i pellet membranosi in un totale di un millilitro di PBS sterile mediante pipettaggio delicato. Mescolare 0,5 millilitri della sospensione di pellet con 1,5 millilitri di soluzione di iodixanolo al 60% sul fondo di una provetta per ultracentrifuga in polipropilene a parete sottile. Sovrapponi questa sospensione di MEV iodixanolo al 45% con un millilitro di soluzioni di iodixanolo al 40%, 35%, 30%, 25% e 20% e un millilitro di PBS nella parte superiore.
Centrifugare a 100.000 volte g per 18 ore a quattro gradi Celsius. Quindi, utilizzare una siringa Hamilton da un millilitro per raccogliere le frazioni del gradiente di densità da un millilitro partendo dall'alto. Diluire ogni frazione raccolta a 20 millilitri con PBS e centrifugare a 100.000 volte g per due ore a quattro gradi Celsius.
Rimuovere il surnatante e risospendere in 0,5 millilitri di PBS.