Isolamento di vescicole extracellulari batteriche mediante cromatografia ad esclusione dimensionale

Eseguire una cromatografia ad esclusione dimensionale o una colonna SEC impacchettata con perle di resina porosa di dimensioni definite. Contiene un serbatoio di campionamento nella parte superiore.

Aggiungere soluzione salina tamponata con fosfato o PBS per equilibrare le perle della colonna ed eliminare il flusso.

Caricare un filtrato di coltura batterica concentrato che contiene vescicole extracellulari o EV, proteine secrete e contaminanti.

Le vescicole extracellulari sono nanovescicole a base lipidica che trasportano molecole bioattive e sono secrete dai batteri.

Una volta che il filtrato entra nelle perline, aggiungere PBS per guidarlo attraverso il letto di resina.

Scartare l'eluato iniziale contenente grandi contaminanti non vescicolari.

Posizionare una provetta di raccolta sotto l'uscita e aggiungere in sequenza il PBS.

Le vescicole extracellulari di grandi dimensioni eludono i pori più piccoli della resina, si muovono attraverso gli spazi interparticellari tra le perle ed eluiscono per prime.

Le proteine e i contaminanti più piccoli entrano nei pori, seguono percorsi più lunghi ed eluiscono in seguito.

Raccogli le frazioni a eluizione precoce contenenti EV e conservale per l'analisi.

Per l'isolamento delle vescicole extracellulari, eseguire la cromatografia ad esclusione dimensionale, o SEC, utilizzando una colonna piccola con un volume del letto di 10 millilitri per meno di 100 millilitri di materiale di partenza e una colonna più grande con un volume del letto di 47 millilitri per più di 100 millilitri di materiale di partenza. Per diverse ore prima dell'esperimento, portare la colonna SEC e il PBS a temperatura ambiente, quindi stabilizzare la colonna in posizione verticale utilizzando un supporto e un supporto da laboratorio standard. Prima di collegarlo alla colonna SEC, idratare il serbatoio del campione lasciando fluire cinque millilitri di PBS attraverso la fritta in un contenitore di scarico.

Quindi, svitare il tappo di ingresso della colonna per aggiungere due millilitri di PBS al serbatoio del campione e collegare con cura il serbatoio alla colonna mentre il PBS gocciola attraverso la fritta. Per l'equilibratura della colonna, aggiungere 47 millilitri di PBS al serbatoio del campione, quindi disostruire il fondo della colonna SEC. Quindi, lasciare che tutto il buffer di campionamento caricato scorra attraverso la colonna ed eliminare il flusso.

Dopo aver caricato due millilitri di campione sul serbatoio del campione, lasciare che il campione entri completamente nella colonna e raccogliere il flusso. Aggiungere immediatamente PBS al serbatoio del campione a un volume di 14,25 millilitri meno il volume del campione per consentire alla soluzione di fluire attraverso la colonna, scartando la quantità pari al volume vuoto della colonna. Quindi, posizionare una microprovetta da due millilitri a basso legame direttamente sotto la colonna SEC per raccogliere il primo flusso passante o frazione dopo aver lasciato scorrere due millilitri di PBS attraverso la colonna.

Continuare ad aggiungere due millilitri di PBS al serbatoio del campione per raccogliere ogni frazione successiva. Conservare le frazioni raccolte a quattro gradi Celsius per la conservazione a breve termine o a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.