JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:39 min • September 26th, 2025
Inizia con embrioni di zebrafish anestetizzati iniettati con batteri patogeni marcati in fluorescenza, da soli o mescolati con microsfere di biomateriali, per modellare l'infezione associata al biomateriale in vivo.
Posizionare una piastra di Petri contenente terreno basale con anestetico sul tavolino di un microscopio a stereofluorescenza dotato di filtri appropriati.
Aggiungere la soluzione di metilcellulosa al piatto per creare un mezzo viscoso che immobilizza gli embrioni per l'imaging.
Trasferisci i singoli embrioni nella metilcellulosa e allineali orizzontalmente, assicurandoti che il sito di iniezione sia visibile.
Utilizzando il filtro a campo chiaro, concentrarsi sul sito di iniezione per individuare la regione infetta.
Imposta i parametri di imaging Z-stack e acquisisci immagini a fluorescenza a diverse profondità per catturare le dinamiche dell'infezione in tre dimensioni.
Utilizzando il software, è possibile analizzare le immagini acquisite nel tempo per quantificare l'intensità della fluorescenza e monitorare la distribuzione batterica.
Questo protocollo consente un confronto diretto della progressione dell'infezione in embrioni vivi con e senza esposizione al biomateriale.
Posizionare una piastra di Petri da 100 millimetri contenente terreno E3 integrato con tricaina allo 0,02% su un tavolino per microscopio a stereofluorescenza e aggiungere 500 microlitri di metilcellulosa al 2% nella piastra di Petri. Per monitorare l'andamento dell'infezione mediante microscopia a fluorescenza, equipaggiare gli appropriati filtri a campo chiaro e fluorescenti, allineare gli embrioni infetti anestetizzati orizzontalmente in un punto di metilcellulosa in una capsula di Petri.
Usa il filtro a campo chiaro per mettere a fuoco il tessuto iniettato danneggiato con un ingrandimento di 160x. Impostare la profondità Z-stack a 10 micrometri e la dimensione del passo a cinque micrometri per consentire la registrazione di tre immagini consecutive. Quindi visualizza i singoli embrioni con impostazioni ottimizzate identiche con un ingrandimento di 160x.
Utilizzare il plug-in ObjectJ in ImageJ per analizzare le immagini.
Questo studio presenta un metodo per visualizzare la dinamica dell'infezione in embrioni di pesce zebra anestetizzati, utilizzando batteri patogeni marcati con fluorescenza. Il protocollo consente un confronto diretto dell'evoluzione dell'infezione in embrioni vivi esposti e non esposti a biomateriali.
L'imaging fluorescente quantitativo in embrioni di pesce zebra consente la visualizzazione diretta e la misurazione in vivo della dinamica delle infezioni batteriche associate ai biomateriali. Questo approccio supporta la validazione precoce degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistica nei portafogli di ricerca e sviluppo di agenti anti-infettivi e biomateriali. Il metodo fornisce dati utilizzabili per prioritizzare materiali e interventi candidati in base alla progressione in tempo reale dell'infezione e alle interazioni ospite-patogeno.
Questo protocollo di imaging si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica per la ricerca e sviluppo di agenti anti-infettivi e biomateriali, collegando studi meccanicistici iniziali e test di efficacia successivi.
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Ultimo aggiornamento: 29 agosto 2026