JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:12 min • September 26th, 2025
Inizia con un piatto contenente una camera di agarosio modellata con scanalature.
Ogni solco contiene embrioni di zebrafish anestetizzati immersi in un mezzo embrionale integrato con un agente anestetico.
Al microscopio ottico, inserire un ago per microiniezione nel tessuto muscolare.
Iniettare una sospensione contenente S. aureus e microsfere di polistirene per modellare un'infezione associata all'impianto.
Trasferire gli embrioni iniettati in pozzetti individuali di una piastra a più pozzetti riempita con un terreno fresco e incubare.
Le microsfere offrono una superficie fisica che supporta la colonizzazione batterica e favorisce l'infezione.
Per valutare l'infezione batterica associata all'impianto, trasferire ogni embrione in una provetta separata e lavarla con un tampone. Aggiungere il tampone e le perline di ceramica.
Omogeneizzare per lisare gli embrioni e rilasciare il contenuto interno, compresi i batteri.
Piastra gli omogeneizzati diluiti, quindi incuba per consentire la formazione di colonie.
Gli embrioni iniettati con la microsfera-sospensione batterica mostrano un numero di colonie più elevato rispetto a quelli iniettati con la sola sospensione batterica. Ciò indica che le microsfere aumentano la suscettibilità alle infezioni.
Dopo aver atteso cinque minuti per l'anestetizzazione degli embrioni, allineare gli embrioni all'interno delle scanalature in un unico orientamento per la loro iniezione. Impostare il microiniettore sulle impostazioni di iniezione appropriate e inserire l'ago nel tessuto muscolare del primo embrione con un angolo compreso tra 45 e 60 gradi al microscopio stereoscopico.
Muovere delicatamente l'ago avanti e indietro per regolare la posizione all'interno del tessuto secondo necessità e utilizzare il pedale del microiniettore per iniettare la sospensione caricata. Quando si inietta una sospensione di microsfere batteriche nel tessuto di embrioni di zebrafish, l'ago deve essere inserito delicatamente ma con una mano ferma. Dopo un inserimento riuscito, è necessario creare uno spazio per i materiali prima dell'iniezione.
E mantenere gli embrioni in terreno E3 senza tricaina in pozzetti individuali di piastre a 48 pozzetti con cambi giornalieri del terreno. Per monitorare la progressione dell'infezione mediante la quantificazione dell'unità formante colonie, trasferire in modo casuale da cinque a sei embrioni infetti vitali in singole microprovette da due millilitri poco dopo l'iniezione e lavare delicatamente gli embrioni con PBS sterile. Dopo aver scartato i lavaggi, aggiungere 100 microlitri di PBS sterile a ciascuna provetta, seguiti da due o tre perle sterili di zirconia di due millimetri di diametro.
Quindi schiacciare gli embrioni in un omogeneizzatore a 3.500 giri/min per 30 secondi e coltivare l'omogeneizzato come dimostrato.