Preparazione di un inoculo batterico unicellulare

Prendi una coltura metabolicamente attiva di Mycobacterium marinum. Ciò garantisce un'elevata vitalità batterica e uno stato fisiologico ottimale.

Centrifugare la coltura per pellettare i batteri.

Scartare il surnatante in eccesso e risospendere il pellet in un terreno fresco contenente un agente disperdente.

Trasferire la sospensione in provette per microcentrifuga e sonicare in condizioni controllate.

La sonicazione interrompe gli aggregati batterici e disperde le cellule, dando luogo a una sospensione vitale di una singola cellula.

Raccogliere la sospensione sonicata in una siringa e farla passare attraverso un filtro a membrana per rimuovere eventuali grumi rimanenti, garantendo una popolazione unicellulare uniforme.

Utilizzando uno spettrofotometro, misurare la densità ottica della sospensione batterica.

Diluire la sospensione con un terreno fresco contenente crioprotettore per raggiungere la concentrazione batterica desiderata preservando la vitalità cellulare.

Aliquotare la sospensione finale a cella singola e conservarla a temperature estremamente basse. Il crioprotettore aiuta a mantenere la vitalità batterica durante la conservazione a lungo termine.

Dopo l'inoculazione secondo il manoscritto, centrifugare la coltura a 3000 volte G per 10 minuti per raccogliere il Mycobacterium marinum sotto forma di pellet. Scartare tutti i microlitri di surnatante tranne 300 e risospendere il pellet.

Aggiungere tre millilitri di terreno 7H9 con glicerolo al 10% per risospendere ulteriormente il pellet, quindi sonicare la sospensione in un bagno d'acqua a 100 watt, con 15 secondi di accensione e 15 secondi di spegnimento, per un totale di due minuti per ottenere un omogeneizzato a singola cellula. Trasferire la sospensione batterica in una siringa da 10 millilitri e passarla attraverso un filtro da cinque micron per rimuovere eventuali grumi batterici. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare la densità ottica della sospensione e diluirla con terreno 7H9 contenente il 10% di glicerolo a OD 600 in uno.

Dividere la sospensione in aliquote da 10 microlitri e conservare in congelatore a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per un ulteriore utilizzo.