JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:27 min. • September 26th, 2025
Iniziare con una coltura di Pseudomonas aeruginosa ricombinante in un terreno di selezione antibiotico.
Questi batteri ospitano un plasmide non replicativo integrato nel genoma vicino al gene bersaglio batterico destinato alla delezione.
L'integrazione è avvenuta tramite sequenze omologhe condivise tra il plasmide e il genoma, risultando in una singola ricombinazione crossover.
Il plasmide codifica per un gene di resistenza agli antibiotici e per il gene sacB , che conferisce sensibilità al saccarosio.
Strisciare i batteri su un terreno contenente saccarosio ma privo dell'antibiotico e incubare.
Senza pressione antibiotica, si verifica una seconda ricombinazione, o un doppio crossover, tra regioni omologhe, asportando il plasmide e il gene bersaglio.
Durante la moltiplicazione batterica, il plasmide asportato non viene trasmesso, rendendo i batteri tolleranti al saccarosio.
Applicare i batteri su un terreno non selettivo e su un terreno contenente saccarosio o l'antibiotico e incubare.
La crescita sul terreno non selettivo e sul saccarosio, ma non sul terreno antibiotico, conferma il successo di un doppio crossover.
Inizia coltivando singole colonie ricombinanti incrociate in brodo di isolamento Pseudomonas o PIB. Inoculare e strisciare 10 microlitri di ciascuna coltura su piastre PIA preriscaldate, integrate con il 10% di saccarosio. Quindi incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius.
Il giorno successivo, rimuovi le piastre dall'incubatrice e ispezionale per verificarne la crescita. La colonia resistente al saccarosio dovrebbe essere ricombinante a doppio crossover. Utilizzare stuzzicadenti sterili per applicare almeno 20 colonie su piastre preriscaldate di PIA, PIA integrato con il 10% di saccarosio e PIA integrato con carbenicillina.
Incubare le piastre durante la notte ed esaminarle per verificarne la crescita il giorno successivo. I veri ricombinanti a doppio crossover saranno sensibili alla carbenicillina e resistenti al saccarosio.