Imaging time-lapse a fluorescenza del ciclo di vita di Streptomyces venezuelae

Prendi una piastra microfluidica con un pozzetto contenente spore di Streptomyces venezuelae, un batterio che forma ife.

Altri pozzetti designati contengono un terreno ricco di sostanze nutritive o esaurito.

Le spore derivano da un ceppo che esprime le proteine fluorescenti DivIVA e FtsZ, che si localizzano rispettivamente sulle punte ifali e sulle pareti trasversali.

Applicare l'olio da immersione sulla lente dell'obiettivo di un microscopio invertito e sulla finestra di imaging della lastra.

Montare la piastra sul tavolino del microscopio e iniziare l'imaging time-lapse.

Caricare le spore nella camera di coltura della piastra.

Quindi, introduci il terreno ricco di sostanze nutritive per avviare la germinazione delle spore.

Man mano che le ife crescono, DivIVA si accumula alle punte ifali, mentre FtsZ forma anelli sparsi alle pareti trasversali.

Quindi, passa al mezzo speso. La mancanza di nutrienti in questo mezzo favorisce la sporulazione.

Nelle ife germogliate, i focolai di DivIVA scompaiono e FtsZ si riorganizza in una scala regolare di anelli di divisione, formando setti di sporulazione.

Nel tempo, la scomparsa della fluorescenza FtsZ nelle stesse ife conferma il completamento della sporulazione.

Preriscaldare la camera climatica a 30 gradi Celsius in anticipo.

Quindi accendere il microscopio e il software di controllo del microscopio. Posizionare un obiettivo ad immersione in olio ad alta apertura numerica e verificare che siano presenti i filtri appropriati e gli specchi diagrammatici impostati per acquisire le immagini di contrasto interferenziale differenziale, insieme alle immagini delle fusioni proteiche fluorescenti gialle e rosse. Posizionare una goccia di olio da immersione nell'obiettivo e nella parte inferiore della finestra di imaging sulla piastra microfluidica.

Montare con cautela il dispositivo microfluidico sigillato sul tavolino del microscopio invertito e fissarlo in posizione. Utilizza gli indicatori di posizione incorporati per mettere a fuoco la finestra di imaging della camera di coltura microfluidica. Concentrarsi sulla parte più a sinistra della prima camera di flusso etichettata A, quindi spostare il tavolino sulla dimensione della trappola cinque, corrispondente all'altezza della trappola di 0,7 micrometri.

Nel software microfluidico, impostare il sistema per caricare le celle dal pozzo di ingresso otto a quattro psi per 15 secondi. Dopo aver eseguito il processo, controllare la densità cellulare nella camera di coltura spostando il tavolino attraverso la finestra di imaging. Se non sono state intrappolate spore, ripetere la fase di caricamento delle cellule o, in alternativa, aumentare la pressione e/o il tempo di caricamento fino a raggiungere la densità cellulare desiderata da una a 10 spore per finestra di imaging.

Fare attenzione a non sovraccaricare la camera di coltura. Quindi, avviare il programma di flusso precedentemente preparato nel software di controllo e lasciare che la piastra microfluidica si equilibri termicamente per un'ora nella fase del microscopio prima di iniziare l'acquisizione dell'immagine. Nel software di controllo del microscopio, impostare un'acquisizione multidimensionale per acquisire più immagini in più posizioni del tavolino nel tempo, specificando prima una directory per il salvataggio automatico dei file di immagine.

Successivamente, vai alle impostazioni di illuminazione e inserisci le impostazioni di illuminazione ottimali predeterminate per ogni costrutto specifico. Quindi imposta una serie temporale per acquisire immagini ogni 40 minuti per 24 ore. Per determinare le posizioni del tavolino e impostare l'autofocus, scansionare la camera di coltura e memorizzare le posizioni del tavolino per ogni posizione di imaging di interesse.

Assicurarsi che le posizioni a stadio singolo siano posizionate a una distanza sufficiente per ridurre al minimo lo sbiancamento delle foto e la tossicità delle foto. Una volta verificate le coordinate Z delle posizioni del palco selezionate, attivare l'autofocus hardware. Quindi avviare l'esperimento time-lapse nel software di controllo del microscopio.

Interrompere l'acquisizione dell'immagine dopo 24-30 ore, o quando le ife nella regione di interesse si sono differenziate in spore. Quindi arrestare il programma di flusso nel software e smontare il dispositivo microfluidico. Preparare la piastra microfluidica usata per la conservazione a breve termine rimuovendo il mezzo rimanente dai pozzetti di ingresso, dal pozzetto di scarto e dal pozzetto di caricamento delle celle.

Quindi riempire i pozzetti usati della corsia A e i pozzetti delle corsie inutilizzate con PBS sterile. Infine, sigillare il piatto con pellicola di pera per evitare che si secchi. E conservare la piastra a quattro gradi Celsius.