JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:20 min • September 26th, 2025
Inizia con una pianta sperimentale con regioni fogliari geneticamente modificate che esprimono grandi frammenti non fluorescenti di proteina fluorescente verde superfolder o sfGFP.
Iniettare queste aree modificate con batteri Pseudomonas contenenti proteine effettrici marcate con il piccolo frammento non fluorescente di sfGFP.
Incubare per consentire l'interazione tra i batteri e le cellule fogliari.
Utilizzando un sistema di secrezione specializzato, Pseudomonas rilascia le proteine effettrici marcate nel citosol della foglia.
La vicinanza tra i frammenti di GFP grandi e piccoli consente il loro assemblaggio in sfGFP fluorescente funzionale, che poi trasloca sulla membrana plasmatica.
Dopo l'incubazione, asportare i dischi fogliari dalle aree iniettate.
Visualizza questi dischi utilizzando un microscopio confocale a scansione laser.
Inizialmente, visualizzare il disco fogliare a bassa intensità laser per ridurre al minimo l'autofluorescenza. Quindi, aumentare la potenza del laser per migliorare la visibilità.
La fluorescenza verde conferma l'avvenuta somministrazione di infezioni batteriche e proteine effettrici nelle cellule vegetali.
Per le foglie di Nicotiana benthamiana , infiltrare la sospensione di Pseudomonas nella stessa area in cui l'Agrobacterium è stato infiltrato due giorni prima.
Infine, ritaglia un disco fogliare dalle foglie inoculate con Pseudomonas. In momenti specifici dopo l'infiltrazione di Pseudomonas, utilizzare un sistema di scansione laser confocale per visualizzare due dischi fogliari di due centimetri quadrati dalla singola pianta. Osservare le celle lontane dal foro di infiltrazione per evitare che le cellule morte vengano uccise dalle ferite.
Gli effettori traslocati dai batteri sono presenti solo in quantità molto piccole. Pertanto, è possibile aumentare la potenza del laser e ottenere un'emissione di fluorescenza per rilevare un segnale fluorescente. Tuttavia, non esagerare per evitare di catturare falsi segnali dall'autofluorescenza dalle cellule vegetali.