JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:37 min • September 26th, 2025
Inizia con due ceppi batterici, un riferimento e un concorrente, ciascuno dei quali esprime un marcatore fluorescente distinto per l'identificazione del ceppo.
Mescolate le varietà in proporzioni uguali e posizionate la miscela su una piastra di agar.
Incubare la piastra per consentire ai ceppi di crescere e interagire.
Il concorrente supera la deformazione di riferimento attraverso meccanismi dipendenti o indipendenti dal contatto.
Nella competizione dipendente dal contatto, il concorrente utilizza sistemi di secrezione specializzati per fornire tossine direttamente nel ceppo di riferimento.
Nella competizione indipendente dal contatto, il concorrente rilascia tossine che si diffondono nel mezzo circostante ed entrano nel ceppo di riferimento.
Queste tossine interrompono i processi essenziali nel ceppo di riferimento, tra cui la sintesi della parete cellulare, la replicazione del DNA e la sintesi proteica, portando all'arresto della crescita, alla morte cellulare e alla riduzione dell'espressione della fluorescenza.
Dopo l'incubazione, esaminare la piastra al microscopio a fluorescenza.
La fluorescenza ridotta nel ceppo di riferimento, rispetto alla fluorescenza più brillante del concorrente, indica interazioni competitive.
Per mescolare il ceppo di riferimento e il ceppo concorrente in un rapporto uno a uno, aggiungere 100 microlitri di ciascun ceppo normalizzato a OD 1,0 a una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri etichettata e vorticare per uno o due secondi. Come controllo, mescola la deformazione di riferimento con una versione differenziata di se stessa e anche del vortice.
È fondamentale raggiungere il corretto rapporto di partenza in quanto può modificare notevolmente l'esito dell'esperimento. Per garantire il successo, questo passaggio può richiedere l'ottimizzazione per una determinata specie batterica. Dopo aver ripetuto questo passaggio per ogni replica biologica, dovrebbero esserci quattro repliche biologiche con ceppi di riferimento marcati in modo differenziale come controlli e quattro repliche biologiche con ceppi di riferimento e concorrenti marcati in modo differenziale.
Per creare punti di coltura che verranno utilizzati per la microscopia a fluorescenza dopo l'incubazione, aggiungere 10 microlitri di ciascuna miscela di controllo e sperimentale su una piastra di Petri contenente agar LBS. Dopo che le macchie si sono completamente asciugate sul banco, incubare le piastre a 24 gradi Celsius per 24 ore.