JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
0 visualizzazioni • 2:28 min. • September 26th, 2025
Inizia con una larva di pesce zebra soppressa con un intestino infettato da Clostridioides difficile, un batterio anaerobio patogeno.
Fissare il tronco dorsale superiore della larva e rimuovere la testa per esporre gli organi interni.
Fissare il tronco medio-dorsale e isolare delicatamente l'intestino dalla cavità corporea.
Trasferire l'intestino isolato in una provetta da microcentrifuga contenente tampone.
Omogeneizzare l'intestino usando un pestello per distruggere il tessuto e rilasciare i microbi intestinali.
Trasferire l'omogenato in una provetta contenente mezzi di allevamento selettivi integrati con antibiotici.
Incubare l'omogenato in una camera anaerobica.
Le condizioni anaerobiche inibiscono la crescita dei batteri aerobici, mentre gli antibiotici mirano e sopprimono specificamente la crescita dei microbi intestinali anaerobi nativi.
Il Clostridioides difficile resiste a questi antibiotici e prolifera in condizioni anaerobiche.
I nutrienti e i fattori di crescita nei mezzi di allevamento promuovono ulteriormente la divisione cellulare, consentendo la crescita di Clostridioides difficile vitale.
Dopo l'eutanasia delle larve di pesce zebra infette, inserire un ago nel tronco dorsale delle larve di pesce zebra vicino alla testa per immobilizzare il pesce zebra. Rimuovere la testa dietro le branchie con una lancetta.
Inserire un secondo ago al centro del tronco dorsale. Inserisci un terzo ago nell'addome del pesce zebra ed estrai l'intestino dalla cavità del corpo. Utilizzare un ago per microiniezione per trasferire da 10 a 15 intestini in una provetta da 1,5 millilitri contenente 200 microlitri di 1X PBS sterile.
Omogeneizzare l'intestino con un pestello per rompere il tessuto e preparare gli omogeneizzati. Assicurati che il pestello raggiunga il fondo del tubo per distruggere completamente tutto l'intestino. Negli omogeneizzati, aggiungere il terreno di allevamento di Clostridioides difficile contenente D-cicloserina e cefoxitina, con o senza taurocolato, e incubare in una camera anaerobica.