JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Microbiologia
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Inizia con una scorta di glicerolo congelata di batteri lattici, microbi anaerobi che crescono senza ossigeno.
Il congelamento espone i batteri allo stress indotto dal freddo, riducendo la loro funzione cellulare.
Agitare il tubo per risospendere le cellule e trasferire un'aliquota in un brodo nutriente. Incubare in condizioni anaerobiche.
In questo ambiente, i batteri generano energia attraverso il metabolismo anaerobico, che ne favorisce il recupero e ripristina l'attività cellulare.
Trasferire la coltura in un brodo fresco per fornire nuovi nutrienti per una rapida divisione cellulare.
Le cellule in crescita attiva acidificano il mezzo, indicando il loro recupero e crescita.
Strisciare la coltura su piastre di agar. Incubare in condizioni anaerobiche per favorire la crescita batterica.
Le cellule metabolicamente attive formano colonie visibili, mentre quelle danneggiate o inattive non riescono a crescere.
Trasferisci le colonie isolate in un brodo fresco, vortice e incuba anaerobicamente per ottenere una coltura pura e ad alte prestazioni.
Questo metodo ripristina le celle vitali per le applicazioni a valle.
Prendi la scorta di glicerolo preparata di batteri lattici, o ceppi LAB, in provette da centrifuga da due millilitri dal congelatore ultrabasso a meno 80 gradi Celsius.
Non lasciarli scongelare prima dell'uso. Pulire e disinfettare l'apertura delle provette da centrifuga con alcool al 70% e agitare delicatamente prima dell'uso. Pipettare circa 250 microlitri della coltura LAB stock dalle provette da centrifuga alle provette MRS fresche da due millilitri.
Agitare delicatamente le provette, parafilmarle e incubarle anaerobicamente durante la notte a 42 gradi Celsius per 12-16 ore. Successivamente, prelevare circa 500 microlitri dalle colture coltivate durante la notte, dalle provette MRS da due millilitri alle provette MRS fresche da sette millilitri, farle vorticare e incubarle anaerobicamente durante la notte a 42 gradi Celsius per 12-16 ore. Valutare la crescita microbica misurando la densità ottica o la crescita delle colture a 610 nanometri con uno spettrofotometro UV visibile e registrare risultati accettabili tra 0,7 e 0,9.
Striare le colture notturne dalle provette MRS da sette millilitri sulle piastre di agar MRS e MRCMPYR e incubarle anaerobicamente per 72 ore a 42 gradi Celsius. Prelevare le colonie isolate dalle piastre di agar, trasferirle in provette MRS fresche da sette millilitri, agitarle delicatamente e incubarle anaerobicamente durante la notte a 42 gradi Celsius per 12-16 ore. Conservare le piastre di agar contenenti i ceppi isolati a quattro gradi Celsius in frigorifero per una settimana.
Successivamente, misurare e confermare la densità ottica dalle provette MRS da sette millilitri delle colture LAB isolate dalle piastre striate a 610 nanometri e utilizzarle come colture di lavoro per tutti gli esperimenti correlati.