Crescita batterica su un chip microfluidico per studiare la resistenza ai farmaci antibiotici

Prendiamo i chip microfluidici con camere di crescita e di farmaco separate da una valvola micromeccanica.

Caricare ceppi mutanti di E. coli wild-type e resistenti al TMP, sospesi in terreni, nelle camere di crescita utilizzando la pressione, dove il trimetoprim (TMP) è l'antibiotico testato.

Quindi, caricare le camere dei farmaci con terreni contenenti una bassa concentrazione di TMP per indurre lo stress cellulare nei batteri.

Azionare la valvola micromeccanica per consentire la diffusione del TMP nelle camere di crescita, consentendo l'ingresso del TMP nei batteri.

Posizionare i chip all'interno dell'incubatore montato sul tavolino del microscopio invertito e avviare l'imaging time-lapse.

Nell'E. coli wild-type, il TMP si lega all'enzima diidrofolato reduttasi, impedendo il legame del diidrofolato e causando filamentazione indotta da stress e ridotta moltiplicazione batterica.

Tuttavia, l'alterata struttura DHFR del ceppo mutante impedisce il legame con il TMP, consentendo la normale moltiplicazione.

Osservare le immagini time-lapse.

L'E. coli wild-type mostra filamentazione e ridotta moltiplicazione durante il trattamento con TMP, mentre il ceppo mutante mostra morfologia e moltiplicazione normali, indicando resistenza agli antibiotici.

Dopo aver scongelato il campione congelato giornalmente a temperatura ambiente per cinque minuti, inoculare una nuova provetta con terreno M9 fresco.

Posizionare il campione in un incubatore vibrante a 37 gradi Celsius per una notte. Il giorno seguente, utilizzare il terreno M9 per diluire il campione microbico di dieci volte e caricarlo nel dispositivo microfluidico pressando il contenitore del campione microbico a cinque PSI. Quindi caricare il fluido contenente TMP nel chip premendo l'M9 con il contenitore TMP a cinque PSI.

Eseguire la miscelazione tra il microbo e il farmaco azionando la valvola micromeccanica tra le due camere sul chip microfluidico per 15 minuti. Infine, posizionare il chip microfluidico nell'incubatore del microscopio montato sul microscopio invertito. Con una telecamera CCD, acquisisci immagini cellulari nella camera di crescita ogni ora per otto ore.

Calcola i dati del numero di cella in base al protocollo di testo.