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Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:16 min • September 26th, 2025
Inizia con un campione d'acqua che contiene batteri presenti nell'acqua e filtralo per rimuovere i detriti.
Trasferire il filtrato diluito su piastre di agar a basso contenuto di nutrienti, ciascuna integrata con un antibiotico specifico. Stendere il filtrato e incubare.
I batteri portatori di uno specifico gene di resistenza agli antibiotici crescono sulle piastre antibiotiche corrispondenti e formano colonie.
Conta le colonie per determinare le unità formanti colonie (CFU), che rappresentano il numero di batteri resistenti agli antibiotici.
Selezionare una singola colonia da ogni piastra e sospenderla in acqua distillata sterile.
Riscaldare la sospensione per lisare le cellule e rilasciare il contenuto intracellulare, incluso il DNA batterico che contiene il gene della resistenza agli antibiotici.
Centrifugare le provette per separare i detriti e raccogliere il surnatante contenente DNA.
Aggiungere reagenti di amplificazione al DNA estratto.
Posizionare le provette in un termociclatore ed eseguire il programma per amplificare una regione specifica del DNA batterico.
Il DNA amplificato è pronto per l'analisi in sequenza per identificare il gene della resistenza agli antibiotici.
Trattare il campione d'acqua in modo asettico filtrandolo attraverso un panno di mussola sterile per rimuovere eventuali particolati. Quindi, diluire in serie il campione di acqua filtrata per ulteriori analisi. Per determinare la conta batterica resistente agli antibiotici, aggiungere gli antibiotici separatamente in provette contenenti 20 millilitri di agar R2A fuso sterile modificato a circa 40 gradi Celsius.
Agitare per mescolare uniformemente e versare su piastre di Petri sterili prima che l'agar si solidifichi. Distribuire 100 microlitri di sospensione batterica sulle rispettive piastre modificate con agar R2A contenenti antibiotico. Incubare le piastre a una temperatura compresa tra 35 e 37 gradi Celsius per 48 ore, quindi determinare la carica batterica.
Per preparare il modello di DNA dagli isolati per la PCR, utilizzando uno stuzzicadenti sterile, prelevare una singola colonia pura isolata dell'isolato che cresce su una piastra di Petri. Sospendi la colonia batterica in 100 microlitri di acqua sterile a doppia distillazione in una provetta da microcentrifuga e falla bollire in un bagno di acqua bollente o in un bagno secco per 10 minuti a 100 gradi Celsius. Centrifugare la sospensione a 10.000 g per due minuti per pellettare i detriti e trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga sterile fresca da utilizzare come modello di DNA grezzo.
Per amplificare la regione V3 del gene 16S rRNA mediante PCR, preparare 40 microlitri della miscela di reazione in una provetta per PCR. Posizionare la provetta nel blocco termico ed eseguire il programma appropriato nel termociclatore PCR.