JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologia
0 visualizzazioni • 3:28 min • September 26th, 2025
Prendi una vasca contenente un terreno di coltura sterile con un pH acido.
Trasferisci uno schermo a rete con piantine di piante nel serbatoio.
Sigillare con un coperchio e un nastro poroso per mantenere la sterilità consentendo lo scambio gassoso.
Incubare agitando per aerare il terreno.
Ispezionare il mezzo per verificare l'assenza di torbidità, che indichi l'assenza di contaminazione batterica.
Individuare un campione su una piastra di coltura e incubarlo per osservare l'assenza di crescita batterica, confermando l'assenza di batteri contaminanti.
Inoculare con Agrobacterium, un patogeno delle piante, e incubare.
Le molecole di segnalazione derivate dalle radici delle piante e il pH acido attivano una proteina sensore legata alla membrana batterica.
L'attivazione induce l'espressione genica, producendo proteine per l'attaccamento batterico alle superfici radicolari.
Dopo l'attaccamento, Agrobacterium rilascia un frammento di DNA, noto come DNA di trasferimento (T-DNA), nelle cellule vegetali attraverso un sistema di secrezione.
Dopo l'integrazione nel genoma della pianta, il T-DNA sintetizza molecole di segnalazione che migliorano la colonizzazione batterica.
In una cappa a flusso sterilizzata, versare 18 millilitri di terreno MS liquido autoclavato in serbatoi cilindrici di vetro sterili con coperchi sterili.
Successivamente, utilizzare una pinza sterile per trasferire delicatamente ogni quadrato a rete con piantine di 10-14 giorni dalla capsula di Petri di terreno semisolido a una vasca cilindrica idroponica. Le piantine mostrate qui sono di erba medica. Sigillare i coperchi sui serbatoi utilizzando del nastro chirurgico poroso.
Quindi, coltiva le piantine a 22-24 gradi Celsius con un periodo fotografico di 16 ore e agitando a 50 giri/min. Prima dell'inoculazione, esaminare attentamente la vasca con le piantine per verificare la presenza di eventuali contaminazioni. Il fluido nei serbatoi non contaminati deve essere limpido e trasparente.
Se i serbatoi sono torbidi per la contaminazione, scartarli e numerare il resto dei serbatoi. Campiona 20 microlitri di terreno idroponico da ogni vasca numerata e posizionalo su una capsula di Petri con brodo Luria o agar LB. Incubare il piatto a 28 gradi Celsius per 28 ore.
Inoculare immediatamente ogni vasca idroponica numerata con 50 microlitri della sospensione di Agrobacterium tumefacians in ogni vasca idroponica numerata. Co-coltivare le piantine e il batterio A. tumefacians a 22-24 gradi Celsius con un periodo fotografico di 16 ore e agitazione a 50 giri/min. Esaminare la piastra LB maculata dopo 12 e 28 ore di incubazione per verificare la sterilità del terreno di coltura idroponica.
In caso di contaminazione, non utilizzare il serbatoio numerato corrispondente inoculato con batteri per ulteriori saggi a valle.